李穎怡，郭翠芬，章瑞南，汪保燦，潘 勤，汪余勤，曹海霞，范建高

隨著不合理的膳食結(jié)構(gòu)和不健康的生活方式的流行，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率在全球逐年上升[1，2]。在我國，NAFLD占慢性肝病的49.3%[3]，是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的一組代謝性肝病，其發(fā)病機制尚未闡明[2，4]。愈來愈多的研究揭示了基因多態(tài)性與NAFLD發(fā)病的關系，patatin樣磷脂酶域3（PNPLA3）、跨膜蛋白6超家族成員2（TM6SF2）、溶血脂酰肌醇?；D(zhuǎn)移酶1（MBOAT7）和葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白（GCKR）等多個基因被認為參與了NAFLD發(fā)生和發(fā)展，尤其在部分非肥胖的NAFLD患者，基因多態(tài)性可能發(fā)揮著重要的作用[5，6]。乙醛脫氫酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是酒精代謝的關鍵作用酶，ALDH2 rs671突變在我國人群高發(fā)，可造成人體對乙醛的代謝能力下降，導致飲酒者“喝酒臉紅”現(xiàn)象。近年來有研究表明，ALDH2 rs671多態(tài)性與酒精性肝病和代謝綜合征密切相關[7，8]。本研究旨在探討ALDH2 rs671多態(tài)性與NAFLD發(fā)病的相關性，希望能發(fā)現(xiàn)我國NAFLD患者新的遺傳危險因素，有助于早期識別易感人群。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2017年3月～2018年3月于上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院消化科住院的患者，排除有過量飲酒史（男性＞140 g/w、女性＞70 g/w）、病毒性肝炎、藥物性肝損傷、膽源性肝損傷、自身免疫性肝病、遺傳代謝性肝病、全胃腸外營養(yǎng)、重度營養(yǎng)不良（BMI＜16 kg/m2）和合并嚴重的心肝腎功能不全者。該研究通過新華醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查，在獲得調(diào)查對象知情同意后開展研究。

1.2 一般資料和血生化檢測 采集性別、年齡、身高、體質(zhì)量、腰圍、臀圍等信息，并計算體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）=體質(zhì)量（kg）/身高 2（m2）、腰臀比=腰圍/臀圍、腰高比=腰圍/身高。所有患者入院第2天晨起空腹抽取靜脈血，使用日本Hitachi公司 7600型全自動生化分析儀檢測血生化指標，計算脂肪肝指數(shù)（fatty liver index，F(xiàn)LI）和胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，HOMA-IR）。

1.3 ALDH2 rs671測序和分型 采集外周靜脈血3 ml，提取基因組DNA，行PCR擴增，使用美國 ABI測序儀測序。ALDH2 rs671位點上游引物為5'-CAAATTACAGGGTCAACTGCTAT-3'，下游引物為5'-CAGCAGGTCCTGAACTTCCA-3'，由生工生物工程股份有限公司設計合成并完成單核苷酸多態(tài)性（SNP）測序和分型。

1.4 肝臟脂肪沉積和彈性檢測 使用Fibroscan 502（法國 Echosens公司）檢測受控衰減參數(shù)（controlled attenuation parameter，CAP）和肝硬度 測 量（liver stiffness measurement，LSM）。CAP 值≥238 dB/m 提示脂肪肝，CAP值＜238 dB/m則歸入無脂肪肝組。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗或Mann-Whitney U檢驗，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，檢驗水準為P＜0.05。采用Pearson x2檢驗進行遺傳平衡檢驗。采用非條件Logistic回歸控制混雜因素，計算比值比（odd ratio，OR）及其95%可信區(qū)間 （confidence interval，CI），表示基因多態(tài)性與NAFLD患病的相對風險度。

2 結(jié)果

2.1 基線資料 納入研究對象120例，男性50例，女性70例；年齡12～80歲，平均年齡為（55.38±12.64）歲。根據(jù)CAP檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪肝73例，無脂肪肝人群47例，兩組間性別和年齡分布無顯著性差異（P＞005）。脂肪肝組合并肥胖、高血壓病和血糖異常的比例明顯高于無脂肪肝組（67.1% 對 23.4%，64.4% 對42.6%和27.4% 對 8.5%）；脂肪肝組體質(zhì)量、BMI、腰圍、臀圍、腰臀比、腰高比、空腹血糖和甘油三酯水平均顯著高于無脂肪肝組（P＜0.05），脂肪肝組血清ALT、AST、GGT水平均顯著高于無脂肪肝組（P＜0.05）。

2.2 ALDH2 rs671基因分型和遺傳平衡檢驗情況ALDH2 rs671位點基因型產(chǎn)物均為288 bp片段（圖1）。經(jīng)測序檢測發(fā)現(xiàn)ALDH2 rs671單核苷酸多態(tài)性為GG、GA和AA 3種基因型，其中GG為野生型，GA為突變雜合型，而AA為突變型（即ALDH2*1/1、ALDH2*1/2和ALDH2*2/2，圖2）。GG、GA和AA基因型分布頻率分別為55.0%、38.3%和6.7%，經(jīng)吻合度檢驗，各組基因多態(tài)性分布均符合Hardy-Weinberg（H-W）遺傳平衡法則（P=0.997），說明樣本來自同一群體（圖3）。

圖1 PCR擴增 顯示ALDH2 rs671位點基因型產(chǎn)物為288 bp片段

2.3 ALDH2 rs671多態(tài)性與脂肪肝患病風險的相關性分析 應用顯性模型和等位基因模型分析發(fā)現(xiàn)脂肪肝組GA/AA型占比（52.1%）顯著高于無脂肪肝組（34.0%），等位基因A占比（29.5%）顯著高于無脂肪肝組（20.2%）。根據(jù)性別和BMI行亞組分析，在女性和超重人群（BMI≥23 kg/m2）中，脂肪肝組GA/AA型占比顯著高于無脂肪肝組（分別為48.8%對22.2%和53.3% 對23.1%，P＜0.05）；經(jīng)非條件Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，GA/AA型脂肪肝患病風險是GG型的3.756倍，校正年齡、性別、BMI、腰圍、空腹血糖、甘油三酯和高血壓后仍具有統(tǒng)計學意義（OR=3.756，95CI%=1.208～11.672，P=0.022）。

2.4 不同ALDH2 rs671基因型者人體學和生化指標的差異分析 GA/AA型者體質(zhì)量、BMI、腰圍、臀圍、腰臀比、腰高比均顯著高于GG型者，其中GG型體質(zhì)量為（66.07±10.39） kg，而 GA/AA型者為（70.87±14.24）kg，兩組間具有顯著性差異（P=0.028）；GG 型者臀圍為（95.35±6.95）cm，GA/AA 型者為（98.04±7.25）cm，兩組間具有顯著性差異（P=0.043）；GA/AA型者腰高比超標（≥0.6）的比例顯著大于GG型者（28.8% 對13.6%，P=0.042）。分別取ALT、AST、GGT 后四分位，將 ALT、AST、GGT 水平超過后四分位者定義為肝酶升高，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GA/AA型者肝酶升高者比例更高，GGT水平顯著高于GG型者【（55.57±99.97） U/L 對（38.17±48.02） U/L，P=0.047】；他們的CAP值和脂肪肝指數(shù)均顯著高于GG 型者【（265.61±56.37） dB/m 對（246.38±60.81）dB/m，P=0.078和（4.15±8.58 對 2.04±3.77，P=0.071），而兩組LSM值無顯著性差異【（4.96±1.49）kPa對（6.22±7.51） kPa，P=0.706】；GA/AA 型者空腹血糖、空腹胰島素、糖化血紅蛋白、HOMA-IR、甘油三酯、總膽固醇、非高密度脂蛋白膽固醇和血尿酸水平均與GG型者無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 ALDH2 rs671測序圖

圖3 ALDH2 rs671基因型和等位基因頻率與遺傳平衡檢驗

3 討論

ALDH2是體內(nèi)乙醛及其他醛類物質(zhì)的關鍵代謝酶[9-11]，參與醛類的清除、能量代謝、脂質(zhì)代謝、氧化應激和細胞凋亡等多種重要的病理生理過程[12-14]。ALDH2基因位于12號染色體上[15]，其主要突變位點ALDH2 rs671在我國高達39%～57%[14]，該突變改變了ALDH2酶的氫鍵穩(wěn)定性，使其催化活性明顯降低，對乙醛的水解能力降低[16]。近年來，國內(nèi)外已有多項研究表明ALDH2 rs671多態(tài)性與冠心病、高血壓病、糖尿病和腫瘤的發(fā)生具有相關性[14]。但ALDH2 rs671多態(tài)性與NAFLD的研究報道目前尚少。

研究酒精代謝在NASH疾病進展中的作用時發(fā)現(xiàn)，ADH和ALDH的表達和功能均出現(xiàn)顯著改變[17]。在該研究的兩個NASH組中均可見4-羥基壬烯醛蛋白加合物的顯著積累和ALDH2蛋白表達的明顯增加，提示ALDH2在對抗NASH氧化應激中發(fā)揮作用。使用ALDH2激動劑Alda-1干預apoE-/-小鼠，可以觀察到動脈粥樣硬化程度及肝臟脂肪變程度的改善，提示激活ALDH2可以改善NAFLD[18]。相反，抑制ALDH2能夠增強乙醛介導的肝細胞固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1通路（sterol regulatory elementbinding protein，SREBP-1）的活性，增加肝臟甘油三酯的沉積[19]。日本Oniki et al[20]在一項隊列研究中，在對341例不飲酒或少量飲酒的研究對象進行4～6年的隨訪后發(fā)現(xiàn)，突變基因ALDH2*2攜帶者中NAFLD發(fā)病率較非攜帶者高，并且，GGT水平升高（≥25.5 IU/L）的ALDH2*2基因攜帶者的NAFLD患病風險顯著升高。在本研究中，脂肪肝組的GA/AA型比例顯著高于無脂肪肝組，經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，GA/AA型者脂肪肝患病風險顯著增加，提示GA/AA型可能是NAFLD的潛在危險因素，并且，對女性和超重患者影響更大。

GGT是過量酒精攝入和肝損傷的標志，也反映了氧化應激程度。GGT水平的升高與肝細胞損傷以及肝臟脂肪沉積程度密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，GA/AA型者GGT水平顯著高于GG型者，提示GA/AA型較GG型人群更容易出現(xiàn)肝細胞損傷和更嚴重的脂肪變。此外，本研究發(fā)現(xiàn)GA/AA型者CAP值和脂肪肝指數(shù)均高于GG型，同時，GA/AA型者ALT、AST、GGT升高的比例也均高于 GG型。攜帶ALDH2*2基因的喝酒臉紅的中國人除了需警惕酒精性肝病的發(fā)生外，還需要警惕脂肪肝以及NASH的發(fā)生。

ALDH2還與脂質(zhì)代謝、脂肪的形成和分布密切相關。研究發(fā)現(xiàn)PKC-ALDH2通路在脂肪細胞的分化中起了重要作用，PKC-ALDH2通路的激活可以增強脂肪細胞分化、加速成脂，并減弱4-羥基壬烯醛介導的PPARγ通路對脂肪生成的異常調(diào)節(jié)。我國和東亞的全基因組關聯(lián)研究顯示ALDH2 rs671是肥胖的易感基因位點，其多態(tài)性與BMI的增加和內(nèi)臟脂肪的沉積具有顯著相關性。本研究數(shù)據(jù)顯示GA/AA型各項人體學指標，如體質(zhì)量、BMI、腰圍、臀圍、腰臀比、腰高比等，均高于GG型，提示ALDH2 rs671基因多態(tài)性與肥胖可能具有潛在的相關性。