張迎明，申 爽，田 飛，孫園園

我國(guó)現(xiàn)階段慢性乙型肝炎（CHB）患者約有2000萬(wàn)[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)抗病毒治療的療效可能與多種免疫學(xué)應(yīng)答基因存在關(guān)聯(lián)，但其具體機(jī)制尚未明確[2，3]。干擾素 λ4（IFNL4）由4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子組成，能特異性結(jié)合于異二聚體Ⅱ類(lèi)細(xì)胞因子受體，具有調(diào)節(jié)免疫和抗病毒功能，體外實(shí)驗(yàn)提示其與抗丙型肝炎病毒療效失敗有關(guān)[4-6]。白介素-28B（IL-28B）是干擾素Ⅲ家族中的重要成員，對(duì)HBV復(fù)制存在抑制作用[7，8]。本研究旨在分析外周血IFNL4和IL-28B基因多態(tài)性對(duì)CHB患者抗病毒治療應(yīng)答的影響，旨在為臨床制定治療方案提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2015年3月～2017年3月我院收治的CHB患者140例，男78例，女62例；年齡27～56歲，平均年齡為（39.64±20.53）歲；體質(zhì)指數(shù)為 18～25 kg/m2，平均為（22.43±1.41） kg/m2。診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[9]的標(biāo)準(zhǔn)。入組前6個(gè)月內(nèi)無(wú)應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑、抗病毒藥物史；（3）無(wú)認(rèn)知障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠或哺乳期婦女；（2）肝癌；（3）肝硬化；（4）有冠心病或糖尿病等基礎(chǔ)疾?。唬?）酒精性肝?。唬?）自身免疫性肝病。本研究方案獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法 給予所有患者聚乙二醇干擾素α-2a（上海羅氏制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20120074）180 μg皮下注射，1 次 /w，治療觀察 12個(gè)月。參照《慢性乙型肝炎防治指南》的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，以血清HBV DNA定量低于最低檢測(cè)限，血清ALT正常視為應(yīng)答，否則視為未應(yīng)答。

1.3 血清檢測(cè) 使用貝克曼庫(kù)爾特AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo)；采用熒光定量PCR法測(cè)定血清HBV DNA（上海恪敏生物）。

1.4 外周血IFNL4和IL-28B基因多態(tài)性檢測(cè) 采用DNA提取試劑盒提取血DNA：（1）取血300 μl，置于離心管內(nèi)，加入細(xì)胞裂解液 600 μl，混勻，10000 r/m離心60 s，分離血清。取緩沖液GS 200 μl，置于細(xì)胞核沉淀物內(nèi)，混勻；（2）加入K溶液20 μl，混勻；（3） 加入緩沖液 GB 200 μl，混勻，于56℃條件下反應(yīng)10 min，混勻，直至溶液呈現(xiàn)為清亮色；（4）加入無(wú)水乙醇 200 μl，混勻，將所得絮狀沉淀物和溶液置于收集管內(nèi)（內(nèi)置吸附柱CB3），12000 r/m 離心 30 s，棄廢液；（5）取漂洗液PW 600 μl，倒入吸附柱CB3內(nèi)，12000 r/m離心30 s，棄廢液；（6）重復(fù)上述步驟；（7）12000 r/m 離心120 s，棄廢液，于室溫下反應(yīng)10 min，晾干殘留漂洗液；（8）加入洗脫緩沖液 TB 200 μl，在室溫下反應(yīng) 5 min，12000 r/m離心 120 s，存放于-20℃冰箱內(nèi)待測(cè)。電泳驗(yàn)證：（1）將齒梳置于膠膜中，倒入瓊脂糖凝膠液，待厚度達(dá)5 mm時(shí)停止；（2）在室溫下反應(yīng)30 min，經(jīng)凝膠固定，將齒梳拔出，取凝膠置于電泳槽內(nèi)；（3）加緩沖液，直至沒(méi)過(guò)膠板；（4）取 DNA 樣品 5 μl，倒入樣孔；（5）電泳 1 h，經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)處理。IL-28B基因分型：經(jīng)SNaPshot技術(shù)對(duì)其基因多態(tài)性進(jìn)行測(cè)定，選取rsrs8099917位點(diǎn)基因進(jìn)行分析。反應(yīng)條件：95℃5 min（95℃ 30 s、64℃ 30 s、72℃ 60 s，35 個(gè)循環(huán)），72℃ 10 min。按照凝膠電泳分析結(jié)果將其分成TT型和TG型；IFNL4基因分型：選取rs368234815位點(diǎn)基因進(jìn)行分析。反應(yīng)條件：95℃10 min（95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)），72℃ 10 min。按照凝膠電泳分析結(jié)果將其分成TT/TT型和TT/△G型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同應(yīng)答的CHB患者血IFNL4和IL-28B基因多態(tài)性比較 在12個(gè)月治療結(jié)束時(shí)，在140例CHB患者中，108例（77.1%）獲得應(yīng)答，32例（22.9%）無(wú)應(yīng)答。CHB患者IFNL4rs368234815位點(diǎn)基因以TT/TT為主，IL-28Brs8099917位點(diǎn)基因以TT為主。應(yīng)答組IL-28Brs8099917位點(diǎn)基因TT型占比顯著高于無(wú)應(yīng)答組（P＜0.05），兩組IFNL4基因型比較無(wú)顯著差異（P＞0.05，表1）。

2.2 應(yīng)答與無(wú)應(yīng)答組患者血清肝功能指標(biāo)和HBV DNA水平比較 治療前，兩組各指標(biāo)比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）；治療結(jié)束時(shí)，應(yīng)答組患者血清ALT、AST和HBV DNA水平顯著低于無(wú)應(yīng)答組，差異顯著（P＜0.05，表2）。

表1 應(yīng)答與未應(yīng)答CHB患者血IFNL4和IL-28B基因多態(tài)性[n（%）]比較

表2 應(yīng)答與無(wú)應(yīng)答組血生化和HBV DNA水平（±s）比較

與未應(yīng)答組比，①P＜0.05

例數(shù)應(yīng)答組 治療前 108 91.2±4.2 93.1±3.0 13.6±1.4 6.1±3.1治療后 35.4±3.2① 38.6±2.1① 16.2±1.5 3.8±2.1①ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） HBV DNA（lg copies/ml）未應(yīng)答組 治療前 32 81.3±4.1 95.0±3.0 16.5±1.3 6.4±3.0治療后 61.5±4.8 73.5±3.0 13.6±1.2 5.2±3.1

2.3 不同IFNL4基因型患者血生化和HBV DNA水平比較 治療結(jié)束時(shí)，IFNL4 TT/TT型與TT/△G型CHB患者肝功能指標(biāo)和HBV DNA水平比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表3）。

表3 不同IFNL4基因型CHB患者血生化和病毒學(xué)指標(biāo)（±s）比較

表3 不同IFNL4基因型CHB患者血生化和病毒學(xué)指標(biāo)（±s）比較

基因分型 例數(shù)TT/TT 125 47.1±2.5 49.1±1.6 15.5±1.3 4.5±1.2 TT/△G 15 48.0±2.1 59.4±1.5 15.9±1.1 4.7±1.3 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） HBV DNA（lg copies/ml）1.338 0.690 1.143 0.605 P 0.183 0.491 0.255 0.546 t

2.4 不同IL-28B基因型患者血生化和HBV DNA水平比較 IL-28B TT型感染患者血清ALT、AST和HBV DNA水平顯著低于TG型（P＜0.05，表4）。

表4 不同IL-28B基因型感染者血生化和病毒學(xué)指標(biāo)（±s）比較

表4 不同IL-28B基因型感染者血生化和病毒學(xué)指標(biāo)（±s）比較

基因分型 例數(shù)TT 118 36.4±2.1 38.9±2.7 16.8±1.2 4.0±1.7 TG 22 59.0±1.4 72.1±1.1 17.1±1.0 6.0±2.1 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） HBV DNA（lg copies/ml）5.572 5.462 4.777 4.875 P 0.000 0.000 0.000 0.000 t

3 討論

近年來(lái)，有研究指出抗病毒療效可能與免疫學(xué)基因多態(tài)性有關(guān)。若患者攜帶優(yōu)勢(shì)基因，則可提高病毒清除率，改善治療效果[10-12]。IFNL4基因是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的基因。在攜帶IFNL4△G基因者，細(xì)胞可分泌IFN-γ4蛋白，但分泌能力并不強(qiáng)。一旦出現(xiàn)病毒感染，可能觸發(fā)肝組織內(nèi)IFN-γ4蛋白的弱表達(dá)，無(wú)法對(duì)感染進(jìn)行有效的抑制[13-16]。IL-28B基因是IFN-γ家族的一員，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)該基因附近部分位點(diǎn)與抗病毒清除能力存在關(guān)聯(lián)[17-19]。

本研究以CHB患者為研究對(duì)象，并選取IFNL4和IL-28B基因多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這兩種基因中，CHB患者主要攜帶IFNL4rs368234815位點(diǎn)的TT/TT型基因和IL-28Brs8099917位點(diǎn)的TT型基因。通過(guò)觀察應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組人群基因分型差異，發(fā)現(xiàn)攜帶IL-28B rs8099917TT基因的患者應(yīng)答率較高，提示該基因型有利于提高HBV清除率。有學(xué)者在丙型肝炎患者的研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶rs8099917 G/T和G/G基因者抗病毒失敗率顯著高于攜帶TT型的患者[20]。另有研究提示在IL-28B基因中，與抗病毒療效相關(guān)的基因多態(tài)性有7個(gè)，其中rs8099917位點(diǎn)的相關(guān)性最強(qiáng)。上述研究均為本研究結(jié)論提供了理論依據(jù)，支持該位點(diǎn)TT基因與抗病毒療效有關(guān)的論點(diǎn)。

本研究提示應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組患者血IFNL4基因多態(tài)性比較無(wú)顯著性差異，表明該基因多態(tài)性可能與抗病毒療效無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。但有學(xué)者認(rèn)為該基因中攜帶TT/TT型患者應(yīng)答率高于攜帶TT/△G型患者，與本研究結(jié)論相悖。其原因還需要認(rèn)真尋找。血清HBV DNA水平是診斷HBV感染的靈敏度和特異度最高的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)IFNL4的TT/TT和TT/△G基因與患者肝功能和HBV DNA水平無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，而IL-28B的TT和TG基因可能與之有關(guān)，需進(jìn)一步研究攜帶IL-28B rs8099917位點(diǎn)TT型基因感染者對(duì)抗病毒療效是否真的好。

綜上所述，檢測(cè)外周血IL-28B rs8099917位點(diǎn)TT型基因可用于預(yù)估CHB患者抗病毒療效，不同基因型感染者可能在血清生化學(xué)和病毒學(xué)指標(biāo)方面存在差異，從而篩選出可能獲得更高抗病毒治療效果的人群，而給予針對(duì)性的治療。