任俞霏，陳小青，孔維宗，王迎春

隨著肥胖、糖尿病和代謝綜合征的患病率不斷攀升，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver diseases，NAFLD）已成為我國(guó)第一大慢性肝病。NAFLD的特征是大量肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，其疾病譜包括非酒精性肝脂肪變（non-alcoholic hepatic steatosis）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[1，2]。自噬是細(xì)胞應(yīng)激和平衡的一種反應(yīng)，通過(guò)自噬途徑可以降解肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴[3，4]。本實(shí)驗(yàn)旨在細(xì)胞水平研究Sal B是否通過(guò)誘導(dǎo)自噬對(duì)模型細(xì)胞脂肪變起到了治療作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人肝癌細(xì)胞HepG2（大連理工大學(xué)細(xì)胞庫(kù)）；棕櫚酸（palmitic acid，PA，上海阿拉丁公司）；Sal B（大連美侖生物科技有限公司）；噻唑藍(lán)（MTT，大連寶生物工程有限公司）；檢測(cè)甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）試劑盒（南京建成生物科技公司）；3- 甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA，美國(guó)Medchemexpress公司）；抗LC3B抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；熒光抗P62抗體（美國(guó)Proteintech公司）；Cy3標(biāo)記的山羊抗兔 IgG、TritonX-100、二脒基苯基吲哚（diamidino-phenyl-indole，DAPI，碧云天生物技術(shù)公司）；山羊血清、抗熒光淬滅劑（上海索萊寶生物科技公司）；油紅O染劑、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、全蛋白提取試劑盒、檢測(cè)谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、羊抗兔IgG-HRP、內(nèi)參抗β-actin、抗P62抗體和ECL發(fā)光液（沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取HepG2細(xì)胞，在含有10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%左右，用PBS洗2次，以0.25%胰酶消化并離心，按1：2進(jìn)行傳代。

1.3 PA和Sal B濃度篩選 采用MTT法，待細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以3×103細(xì)胞/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度（0、0.25、0.5、0.75、1 mM） 的 PA和不同濃度（0、5、10、25、50 μM）的 Sal B，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。然后，加入MTT 20 μl/孔，培養(yǎng)4 h，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定光密度（optical density，OD）值。

1.4 細(xì)胞內(nèi)脂滴觀察 取HepG2細(xì)胞，分為對(duì)照組（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）、模型組、干預(yù)組和抑制劑組，其中模型組用0.5 mM PA干預(yù)24 h；干預(yù)組用0.5 mM PA干預(yù)24 h，再給予10 μM Sal B干預(yù)24 h；在抑制劑組，預(yù)先加入5 mM 3-MA處理2 h，接著加0.5 mM PA干預(yù)24 h，再加入10 μM Sal B繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將HepG2細(xì)胞以2.0×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，PBS洗滌5 min，×3次，用4%多聚甲醛固定液在室溫下固定30 min；PBS洗滌2～3遍，加油紅O，避光、37℃染色20 min，去除油紅O，加60%異丙醇沖洗；PBS洗至透明，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴。之后，將每組細(xì)胞溶解在500 μl/孔異丙醇中10 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)510 nm處OD值。

1.5 細(xì)胞上清生化指標(biāo)測(cè)定 在藥物分組干預(yù)后，收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重懸于PBS中，超聲處理并裂解，離心10 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫熒光染色法，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15 min，除去固定液，PBS洗5 min×3次；滴加0.1%TritonX-100，室溫孵育30 min，去除0.1%TritonX-100，PBS洗5 min×3次；滴加山羊血清覆蓋細(xì)胞，室溫15 min；加一抗，在4℃孵育過(guò)夜，除去一抗，PBS洗5 min×3次；在室溫下加免疫熒光二抗，孵育1 h（避光），用PBS洗5 min×3次；加DAPI復(fù)染核，清除DAPI，PBS清洗；將載玻片置于有淬滅劑的載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度并拍照。隨機(jī)選取每組免疫熒光圖片4個(gè)視野，應(yīng)用IPP軟件對(duì)圖片進(jìn)行積分光密度（integrated optical density，IOD）量化分析，求取平均值，作為該蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

1.7 細(xì)胞LC3B蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western Blot法，消化收集各組處理的細(xì)胞，用RIPA 200 μL充分裂解提取蛋白，BCA法測(cè)樣品蛋白濃度，計(jì)算每組蛋白濃度，上樣至泳道，電泳80 v恒壓2.5 h，凝膠分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，加入不同稀釋度的一抗（1：1000），于4℃孵育盒中封閉過(guò)夜，加二抗孵育1 h。以化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2.1 篩選藥物濃度情況 與對(duì)照組比，經(jīng)0.75 mM和1.0 mM PA處理，顯著地抑制了細(xì)胞活力（P＜0.05），而低于0.5 mM的PA濃度對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。因此，選擇0.5 mM處理細(xì)胞24 h為PA最佳造模濃度；不同濃度的Sal B處理HepG2細(xì)胞24 h，結(jié)果表明，經(jīng)10 μM Sal B處理，對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯的抑制作用。所以，選定10 μM Sal B處理24 h為最佳干預(yù)濃度（表1）。

表1 不同濃度藥物處理細(xì)胞活性（OD值，±s）比較

表1 不同濃度藥物處理細(xì)胞活性（OD值，±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05

PA OD值 Sal B OD值對(duì)照組 0.49±0.06 對(duì)照組 0.47±0.05 0.25 mM 0.47±0.05 5 μM 0.46±0.04 0.5 mM 0.46±0.04 10 μM 0.43±0.04 0.75 mM 0.40±0.03① 25 μM 0.41±0.02①1 mM 0.31±0.03① 50 μM 0.35±0.03①

2.2 各組生化指標(biāo)比較 與對(duì)照組比，PA模型組生化指標(biāo)顯著升高（P＜0.01）；Sal B干預(yù)組和抑制劑組生化指標(biāo)較模型組顯著降低，而經(jīng)抑制劑處理，生化指標(biāo)又有所升高（P＜0.05，表2），提示Sal B可明顯改善細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。

2.3 各組細(xì)胞脂滴變化比較 模型組OD值為（0.666±0.009），較對(duì)照組的（0.247±0.011）顯著升高；干預(yù)組OD值為（0.477±0.013），抑制劑組為（0.507±0.002），較模型組顯著降低，而較干預(yù)組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1018.832，P＜0.001，圖1）。

2.4 各組細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)比較 在熒光顯微鏡下，與對(duì)照組細(xì)胞LC3B表達(dá)熒光強(qiáng)度（1.00±0.00）比，模型組為（1.15±0.15），熒光強(qiáng)度增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干預(yù)組細(xì)胞LC3B熒光強(qiáng)度為（6.60±0.01），比模型組顯著增強(qiáng)（P＜0.01），而抑制劑組為（3.34±0.12），比干預(yù)組顯著減弱（P＜0.05，圖2、圖3）。

表2 各組培養(yǎng)上清生化指標(biāo)（±s）比較

表2 各組培養(yǎng)上清生化指標(biāo)（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.05，③P＜0.05；與干預(yù)組比，③P＜0.05

孔數(shù) TC（mmol/L） TG（mmol/L） ALT（IU/L） AST（IU/L）對(duì)照組 3 0.14±0.02 0.26±0.03 23.37±2.24 27.27±3.19模型組 3 0.57±0.07① 0.99±0.07① 98.47±7.00① 88.36±8.54①干預(yù)組 3 0.30±0.04② 0.56±0.06② 53.36±5.33② 56.37±7.66②抑制劑 3 0.43±0.02③ 0.83±0.10③ 86.84±3.37③ 75.82±3.43③

圖1 各組細(xì)胞脂滴變化（油紅O染色，400×）

圖2 不同細(xì)胞組熒光強(qiáng)度比較 各組顯示紅色熒光為自噬蛋白LC3B表達(dá)，藍(lán)色熒光為核染色DAPI表達(dá)，Merge為紅色熒光LC3B與藍(lán)色熒光DAPI的融合表達(dá)（400×）

2.5 各組細(xì)胞LC3B蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組細(xì)胞LC3B蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.18±0.02）比，模型組為（0.22±0.02），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；干預(yù)組細(xì)胞LC3BⅡ/Ⅰ表達(dá)量為（0.97±0.01），比模型細(xì)胞顯著增強(qiáng)（P＜0.01），而抑制劑組為（0.44±0.05），有所降低（P＜0.05，圖4、圖5）。

圖3 各組細(xì)胞LC3B表達(dá)相對(duì)熒光強(qiáng)度比較

圖4 不同組細(xì)胞LC3B蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較

圖5 各組細(xì)胞LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)半定量分析

3 討論

本研究結(jié)果顯示Sal B具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用，與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[3-6]。Sal B是丹參中水溶性單體的有效成分，可有效降低高脂飼養(yǎng)大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平[2]。Sal B可能是通過(guò)PI3K/Akt/Nrf2途徑抑制氧化應(yīng)激[5-9]。研究發(fā)現(xiàn)Sal B可有效抑制肝細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)死亡受體和線粒體通路相關(guān)[10-13]。Sal B是一種新型自噬誘導(dǎo)劑，通過(guò)抑制AKT/mTOR途徑在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞發(fā)揮其抗腫瘤活性[14，15]。由于PA誘導(dǎo)的自噬促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝而減少脂質(zhì)堆積，從而減少PA引起的脂質(zhì)毒性，即自噬可降解脂滴[16，17]。

為了驗(yàn)證Sal B對(duì)細(xì)胞脂滴的作用機(jī)制是否是通過(guò)自噬，我們應(yīng)用3-MA預(yù)先干預(yù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，再用Sal B處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sal B的治療作用與其增強(qiáng)細(xì)胞自噬有關(guān)。在體外培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞，增強(qiáng)自噬可以減少細(xì)胞脂肪的沉積，而抑制自噬可增加甘油三酯的儲(chǔ)積[18]。自噬可選擇性地隔離和降解功能失調(diào)的線粒體，以防止細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的活性氧蓄積和細(xì)胞死亡[19]。在脂肪性肝炎時(shí)，受損的線粒體功能不能及時(shí)處理氧化應(yīng)激反應(yīng)，脂質(zhì)介導(dǎo)的自噬抑制可能不再保護(hù)線粒體功能，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。

目前，研究自噬在 NAFLD領(lǐng)域還處于起步階段，自噬激動(dòng)劑和抑制劑在臨床應(yīng)用的合理性尚無(wú)理論和經(jīng)驗(yàn)的論證支持。