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        基于血腦屏障靶向多肽的腦神經(jīng)分析化學研究進展

        2019-11-12 06:29:25黃嫣嫣趙睿
        分析化學 2019年10期

        黃嫣嫣 趙睿

        摘?要?將用于分析檢測的分子或材料透過血腦屏障(Blood?brain barrier, BBB),使其高效靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng),是實現(xiàn)原位、在體腦神經(jīng)化學分析亟需解決的問題。多肽作為內(nèi)源性生理活性物質(zhì),具有模塊化的結(jié)構(gòu),不僅設計性強、構(gòu)象可預測,而且利用固相合成方法可高效、低干擾地獲得目標序列。以小分子多肽為穿梭工具,可將熒光分子、造影劑、納米顆粒等高效、快速地轉(zhuǎn)運到目標位置,為腦科學研究及相關(guān)疾病的檢測、分子機制研究提供新方法和新技術(shù)。本文圍繞BBB和多肽的特點,從BBB穿透途徑和靶向多肽設計篩選方法出發(fā),對近年來基于多肽(Peptide shuttles)的BBB靶向分析的研究進展進行了總結(jié)和評述,期望從分子、細胞到活體的角度為腦神經(jīng)分析化學研究提供參考和借鑒。

        關(guān)鍵詞?血腦屏障; 多肽; 靶向分析; 親和篩選; 評述

        1?引 言

        腦功能的發(fā)揮離不開各種化學物質(zhì),從蛋白質(zhì)等大分子到神經(jīng)肽、氨基酸、膽堿等小分子,執(zhí)行并調(diào)控著神經(jīng)細胞內(nèi)部、神經(jīng)細胞之間以及大腦和外周神經(jīng)之間的信號傳遞[1~3]。以腦神經(jīng)化學物質(zhì)及其特征分子活動為目標,在細胞、組織和活體層次開展實時、動態(tài)和原位分析檢測,對于腦功能的解析、腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究具有重要意義[4,5]。血腦屏障(Blood?brain barrier, BBB)是腦神經(jīng)分析化學面臨的一個挑戰(zhàn)。人工設計的分子、材料或藥物,必須要穿透BBB才能實現(xiàn)原位活體檢測、示蹤或調(diào)控的目的[6~8]。作為維護中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的物理和功能屏障,由腦毛細血管內(nèi)皮細胞與星型膠質(zhì)細胞、基膜等構(gòu)成的BBB具有致密結(jié)構(gòu)(圖1),對進入的分子具有極其嚴苛的選擇性和限制,阻擋了98%的小分子物質(zhì)和幾乎所有大分子從血液進入腦組織[9~11]。因此,如何將用于分析檢測的探針透過BBB,使其高效靶向地到達中樞神經(jīng)系統(tǒng),是實現(xiàn)原位、在體腦神經(jīng)化學分析亟需解決的問題。隨著化學、生物學和材料等學科的快速發(fā)展,以及對BBB認識的逐漸深入,新的分子、納米材料和機制不斷被發(fā)現(xiàn)或構(gòu)建,用于穿梭BBB,在眾多領(lǐng)域成為研究的熱點[7,12~14]。

        多肽作為內(nèi)源性的生理活性物質(zhì),具有生物相容性高、組織穿透能力強、性質(zhì)穩(wěn)定等特點[15~17]。此外,多肽分子具有模塊化的結(jié)構(gòu),不僅設計性強、構(gòu)象可預測,而且利用固相合成方法可高效、低干擾地獲得目標序列。人工設計、合成和篩選高親和力、高選擇性的多肽是近年來的研究熱點[18~20]。由于特殊的物理化學性質(zhì)和生物學效應,越來越多的多肽被發(fā)現(xiàn)具有穿透生物屏障的能力,這些生物屏障不僅有BBB,還包括細胞膜和胃腸道膜[12,13,21]。以這些多肽為工具,可將用于腦成像的熒光分子、造影劑、納米顆粒等高效、快速地轉(zhuǎn)運到目標位置,實現(xiàn)腦神經(jīng)化學物質(zhì)和信號的原位、實時動態(tài)分析,進而為腦科學及相關(guān)疾病的檢測、分子機制研究提供新方法和新技術(shù)。本文圍繞BBB和多肽的特點,從BBB穿透途徑和靶向多肽設計篩選方法出發(fā),對近年來基于多肽(Peptide shuttles)的BBB靶向分析研究進展進行了歸納總結(jié),期望從分子、細胞到活體的角度為腦神經(jīng)分析化學研究提供參考和借鑒。

        2?多肽與血腦屏障

        BBB是所有物質(zhì)進入大腦的必經(jīng)之路,然而大腦毛細血管內(nèi)皮細胞致密連接,阻斷了外源性物質(zhì)以細胞間轉(zhuǎn)運的方式進入大腦(圖1)[9,13,22]。在疾病治療過程中,多數(shù)藥物進入大腦中常是侵入性的,涉及高風險的腦損傷或神經(jīng)功能障礙[13,23]。顯然,該方法無法滿足原位、無損分析的要求。避開細胞間質(zhì)輸運,通過細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運克服BBB,成為一種理想方式,也成為腦分析常見的策略[12,13]。

        BBB和其它生物屏障(如細胞膜)具有類似的化學性質(zhì),其中之一便是高度親脂性[9]。因此,增加親脂性成為提高被動運輸穿透內(nèi)皮細胞效率的方法。此外,引入正電荷可增加分子和細胞表面陰離子(如糖蛋白)的相互作用,從而介導內(nèi)皮細胞攝入和被動運輸[24]。然而,這些化學修飾不具有選擇性,所獲得的產(chǎn)物在透過BBB的同時,也被其它組織攝取,導致脫靶。為了提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)的靶向選擇性,可采用仿生修飾方法提高小分子的BBB穿透能力。一些生命活動的必需物質(zhì)(激素、葡萄糖、氨基酸等)能快速、高效地進入大腦[25]。以這些分子的結(jié)構(gòu)為指導,對目標探針進行設計和修飾,可望用于腦神經(jīng)系統(tǒng)分析。

        相比于對每種特定化合物進行修飾,從而賦予其BBB穿透能力,發(fā)展可用于不同類別客體分子的輸運載體,更具有通用性。BBB shuttles的概念最早由Pardridge教授于1986年提出[26]。第一個成功實驗的是正電荷修飾的白蛋白[27],如前所述,簡單電荷修飾的被動運輸缺少組織靶向性,腦部聚集效率不能滿足研究的要求?;诜肿幼R別的主動運輸方法由抗體首先實現(xiàn)[28]。以靶向細胞表面受體的抗體為載體,提高了BBB透過性,但抗原?抗體的極高親和力使抗體滯留在BBB[29],實際進入腦實質(zhì)的效率降低。BBB shuttles在歷經(jīng)蛋白質(zhì)、抗體分子之后,多肽成為了近十年的關(guān)注點。

        多肽具有可設計性、穩(wěn)定性、細胞核組織穿透性等獨特優(yōu)勢,使其成為理想的BBB shuttles。同時,多肽相互作用親和力可控,合適的親和力有利于分子從BBB進一步到腦實質(zhì)的釋放。氨基酸是多肽的構(gòu)建單元,其種類多樣,結(jié)構(gòu)靈活,具有豐富的可修飾位點,可用于功能化或客體偶聯(lián)。從早期的源自于HIV病毒的TAT多肽實現(xiàn)跨越BBB轉(zhuǎn)運酶[30,31],到僅有3個氨基酸殘基的小分子轉(zhuǎn)運載體谷胱甘肽(GSH)[32],多肽作為BBB shuttles的研究發(fā)展迅速。尤其在近五年,研究者設計和發(fā)現(xiàn)了30余種BBB轉(zhuǎn)運多肽 [12,13],展現(xiàn)出更高的穿透效率和功能多樣性,成為開展腦神經(jīng)化學分析不可或缺的有力工具。

        3?BBB靶向轉(zhuǎn)運肽的設計和親和篩選

        多肽穿透BBB的途徑分為被動運輸和主動運輸(圖2A)[33]。一些典型的BBB轉(zhuǎn)運多肽如表1所列。由于致密的BBB細胞間質(zhì)難以透過,經(jīng)BBB內(nèi)皮細胞攝入成為了跨越屏障的主要方式。因此,可結(jié)合并進入細胞的多肽常是BBB shuttles的候選化合物。研究者從分子識別、結(jié)構(gòu)設計或化合物庫構(gòu)建出發(fā),采用生命分析化學方法進行篩選,以期獲得新型BBB轉(zhuǎn)運多肽(圖2B)[13]。

        新的BBB轉(zhuǎn)運體系的發(fā)現(xiàn)需要建立合理有效的篩選鑒定方法。目前,BBB體外篩選模型主要有基&:指Spengler等[40]描述的3字母氨基酸代碼(Stands for 3?letter amino acid code from one described by Spengler et al[40]); [Dap]:二氨基丙酸(Diaminopropionic acid)。

        于細胞的體外篩選模型和平行人工膜滲透裝置等[13]。在這些篩選分析的最后一步,往往需要利用高效液相色譜(High?performance liquid chromatography, HPLC)對Transwell系統(tǒng)中的多肽進行分離和定量分析,以確定不同多肽透過BBB的效率[41]。隨著分析裝置向微型化、微量化方向發(fā)展,對鑒定檢測的靈敏度提出了更高的要求,LC?MS/MS成為多肽定量分析的主要手段。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,最近建立了基于內(nèi)標定量的MALDI?TOF MS方法用于BBB模型中多肽穿透效率的評價,具有快速、簡便和綠色環(huán)保的優(yōu)勢[41]。此外,BBB轉(zhuǎn)運活體研究模型主要借助腦部微透析、熒光/化學發(fā)光等成像技術(shù)[13],對進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的候選化合物進行原位的定性與定量分析。分析方法和技術(shù)的進步為高效、準確的體外篩選提供了重要保障。

        3.1?被動運輸多肽的設計和篩選

        被動運輸多肽進入細胞時不依賴受體識別,而是采用非特異性攝入的方式。其特征理化性質(zhì)包括親脂性、富含正電荷或利于插入細胞膜的SymbolaA@螺旋[12]。細胞穿膜肽(Cell?penetrating peptides, CPPs)具有高效的細胞穿透能力,常作為穿透大腦內(nèi)皮細胞的載體,是被動運輸多肽的代表[42,43]。大部分CPPs源于天然的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),如HIV病毒膜融合相關(guān)蛋白質(zhì)中的TAT多肽[31]。通過非特異性的細胞內(nèi)吞作用(Adsorptive?mediated transcytosis,AMT),可增加熒光染料、酶和納米顆粒等的BBB透過效率,將其運載至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[42]。

        基于TAT等多肽結(jié)構(gòu),通過仿生設計得到的寡聚精氨酸,屬于人工設計的BBB運載多肽[44]。基于遺傳算法的結(jié)構(gòu)優(yōu)化方法也被用于多肽物理化學性質(zhì)的設計,調(diào)控的參數(shù)涉及氫鍵單元、脂水分配系數(shù)(lgP)等[45]。研究表明,N?甲基化的多肽具有穿透BBB的能力[28,46],在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的具有N?MePhe重復單元的多肽,如(N?MePhe)4,曾被認為是被動運輸型BBB shuttles的金標準(Gold?standard)[33]。從體外構(gòu)建的BBB模型到活體應用,上述多肽實現(xiàn)了不同荷載分子的高效腦部運輸。

        多肽化合物庫(Peptide library)以其高度多樣性成為新型功能分子的重要來源,無疑也為BBB轉(zhuǎn)運多肽的發(fā)現(xiàn)提供了豐富的資源(圖2)[18,47,48]。將肽庫與分子設計相結(jié)合,Malakoutikhah等[49]設計了一系列多肽候選化合物,構(gòu)建了固定化膜親和色譜體系和體外膜滲透性分析體系,通過肽鏈長度、端基類型和取代氨基酸的篩選,獲得了透過率高、生物相容性好的優(yōu)選多肽,具有成為BBB被動運輸有效載體的潛力。相比于被動運輸多肽,肽庫設計篩選更多地用于主動運輸型BBB轉(zhuǎn)運肽的構(gòu)建,為獲得具有靶向特異性的多肽提供了有效途徑。

        在已有的BBB被動轉(zhuǎn)運載體中,親脂性化合物仍占多數(shù),但其水溶性差,阻礙其進一步的活體分析和生物應用。因此,設計篩選水溶性的BBB轉(zhuǎn)運多肽成為研究熱點。利用脯氨酸水溶性高、特殊的亞胺和環(huán)形分子結(jié)構(gòu)等特點,Arranz?Gibert等[33]將經(jīng)典的N?MePhe序列與多聚脯氨酸結(jié)合,設計出新型轉(zhuǎn)運多肽,不僅具有高效的BBB轉(zhuǎn)運能力,而且水溶性增加了1000倍。通過替換多肽序列中氨基酸對映體,發(fā)現(xiàn)了生物膜穿透能力的手性歧視效應,并解析了這種歧視效應可能來源于不同手性氨基酸導致多肽二級構(gòu)象的差異性。具有高水溶性的被動運輸多肽在腦神經(jīng)系統(tǒng)細胞標記和成像分析中具有良好的應用前景。

        3.2?主動運輸多肽的設計篩選

        主動運輸多肽通過與血腦屏障界面處的受體分子相互作用,進而由受體介導的內(nèi)吞作用進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。與其它BBB轉(zhuǎn)運方式相比,主動運輸由于具有靶向特異性,增加了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的富集效率,避免了外周組織非特異性分布的脫靶效應[12,13,42],在分析檢測時降低了背景噪音,大大提高了選擇性和靈敏度。不僅如此,主動運輸方式能夠攜帶的物質(zhì)更為廣泛,基本不受尺寸、表面電荷等物理化學性質(zhì)的影響[12]。因此,針對BBB特有受體的分子特征,發(fā)展主動運輸多肽設計篩選新方法,對于腦神經(jīng)化學分析的發(fā)展具有重要意義。

        天然存在的神經(jīng)生物活性物質(zhì)是BBB主動運輸多肽的來源之一(圖2),包括內(nèi)源性物質(zhì),如激素、神經(jīng)肽和脂蛋白等,也可以是外源性的病毒和神經(jīng)毒素[13]。最近,Pradhan等[50]從兩棲動物大腦神經(jīng)肽中獲取了一個具有活性的四肽片段Ser?Leu?Lys?Pro(SLKP),經(jīng)過結(jié)構(gòu)再設計的SLKP類肽成功穿透了BBB的,并具有促進神經(jīng)突觸生長的活性(圖3A)。蜂毒神經(jīng)毒素是具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)主動靶向能力的天然物質(zhì),但其生物毒性大,免疫原性及易被蛋白酶酶解的缺點阻礙其在腦神經(jīng)分析化學中的應用。為了解決上述問題,Teixidó研究組對蜂毒肽Apamin結(jié)構(gòu)進行了結(jié)構(gòu)精煉和設計,獲得了環(huán)狀內(nèi)酰胺類肽MiniAp?4,不僅具有更高效的BBB主動運輸能力,而且低毒、抗降解; 其具有的、可功能化的官能團,有利于熒光分子、蛋白質(zhì)和納米顆粒的修飾,是理想的轉(zhuǎn)運載體[35]?;诃h(huán)狀內(nèi)酰胺橋連結(jié)構(gòu)有利于抑制多肽活體降解,該研究組以動物毒液成分為基礎(chǔ),設計了環(huán)狀小肽用于金納米顆粒的功能化。在體外細胞模型中,環(huán)肽攜帶運載的納米顆粒可穿透內(nèi)皮細胞,證明天然存在的神經(jīng)活性物質(zhì)可為BBB主動運輸多肽設計和發(fā)現(xiàn)提供有益的借鑒(圖3B)[51]。

        主動運輸中起介導作用的受體非常適合作為多肽化合物庫篩選的靶標,從數(shù)目龐大的候選多肽中選出與其具有高結(jié)合力的主動靶向多肽。無論是基于生物方法的噬菌體展示肽庫(Phage display peptide library),還是基于化學合成的組合肽庫(Combinatorial peptide library),都已成為主動靶向多肽的重要來源。以大腦內(nèi)皮細胞高表達的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin receptor, TfR)為靶標,Teixidó研究組利用體外BBB模型對所構(gòu)建的噬菌體展示肽庫進行篩選,獲得了與TfR具有高親和力相互作用的十二肽THRre,在細胞和活體層次均顯示出BBB的高效穿透和荷載轉(zhuǎn)運能力[36]。最近,該課題組為了解決活體穩(wěn)定性的問題,對THRre進行了結(jié)構(gòu)設計和優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)二分支的二價多肽可顯著增加BBB攝入效率和對綠色熒光蛋白質(zhì)的運載能力,實現(xiàn)了細胞的成像分析[52]。同樣以TfR為靶標,Tan等[53]開展了噬菌體展示肽庫的多輪篩選,并設置了陰性對照篩選體系,提高了多肽篩選的準確性。通過競爭結(jié)合實驗,解析了優(yōu)選多肽與TfR的結(jié)合位點; 利用共聚焦激光掃描顯微鏡和流式細胞分析確證了多肽和TfR高表達細胞的親和力和特異性,有望成為BBB靶向多肽。

        受體的正確選擇是成功發(fā)現(xiàn)靶向多肽的前提。目前,用于主動運輸多肽篩選的受體有限,除了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體,還有低密度脂蛋白、乙酰膽堿受體和胰島素等。2007年,Kumar等[37]從病毒糖蛋白中獲得了由29個氨基酸組成的多肽RVG,并發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)細胞高表達的乙酰膽堿受體有特異性結(jié)合作用; 利用精氨酸進一步功能化構(gòu)建的RVG?9R主動運輸系統(tǒng),成功實現(xiàn)了RNA的腦部轉(zhuǎn)運。Mann等[55]以低密度脂蛋白(LDLR)受體為靶標,在高表達LDLR的細胞中開展了噬菌體展示肽庫的篩選,獲得了與靶標受體具有親和力的環(huán)肽; 通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化,進一步增強了與LDLR的親和力和特異性,實現(xiàn)了小分子、抗體片段等不同物質(zhì)的腦部高效輸運。Picciolini等[56]以腦損傷相關(guān)的蛋白多糖復合物為標志物,在小鼠體內(nèi)開展了噬菌體展示肽庫的活體篩選。通過高通量篩選鑒定由尾靜脈定位至腦部的噬菌體,得到了一個短肽CAQK,不僅具有靶向主動運載小分子的能力,還可作為納米材料的表面修飾分子,特異性地將生物大分子轉(zhuǎn)運到損傷位置。

        4?基于靶向多肽的腦神經(jīng)化學分析新方法

        抗體作為經(jīng)典的分子識別工具,具有高選擇性和高親和力。將抗原?抗體識別與光學、電化學等可檢測信號相結(jié)合,已用于神經(jīng)退行性疾病相關(guān)關(guān)鍵分子和物質(zhì)的分析[56~58]。然而,作為生物大分子,抗體存在分子尺寸大、穿透性差、免疫原性等問題; 此外,其制備過程費時費力、易失活等性質(zhì)也限制了其應用范圍。利用多肽與靶標分子的特異性識別和BBB轉(zhuǎn)運能力,開展腦神經(jīng)化學物質(zhì)和信息的高選擇性、高靈敏度分析檢測,對于腦功能分子機制的揭示、生理病理過程的監(jiān)測和調(diào)控都具有重要意義。近幾年,以多肽為識別元件和BBB轉(zhuǎn)運載體,將信號分子或納米材料高效輸送至中樞神經(jīng)系統(tǒng),建立原位、實時的成像分析方法,從分子、細胞到活體水平為腦神經(jīng)化學研究提供了直接的可視化證據(jù)。

        4.1?基于BBB靶向多肽的影像學分析方法

        經(jīng)典的生物影像技術(shù),如核磁共振成像(Nuclear magnetic resonance imaging, NMRi)、計算機斷層掃描(Computed tomography, CT)、正電子發(fā)射斷層掃描(Positron emission tomography, PET)等,推動了神經(jīng)生理學和認知神經(jīng)科學的快速發(fā)展。以靶向多肽對造影劑或顯影劑進行功能化,可提高BBB的穿透和富集效率,降低毒性,增加穩(wěn)定性和水溶性,在腦部病變的早期檢測中被廣泛研究和應用[59,60]。

        美國堪薩斯大學Tabanor等[61]采用羧基端酰胺化的六肽HAV6(Ac?SHAVSS?NH2),考察了多肽功能化前后的釓試劑在腦部NMRi成像中的效果。經(jīng)過尾靜脈注射,含有多肽的釓顯影劑獲得了更好的腦部定位和富集效率; 在多肽的作用下,在不同腦區(qū)都可檢測到核磁信號,顯示了多肽對小分子顯影劑的腦部輸運能力。基于谷胱甘肽(GSH)與GSH受體的特異性識別作用,Nosrati等[62]設計合成了GSH功能化的磁性納米材料,利用NMRi開展了小鼠模型中納米材料的成像分布分析,觀測到多肽介導的BBB高效穿透和負載分子的靶向富集效應。

        納米顆??山M裝不同的功能單元,已成為疾病檢測和治療研究的熱點。Frigell等[63]以葡萄糖保護的金納米顆粒為平臺,組裝了68Ga試劑作為PET信號團,以兩條阿片樣神經(jīng)肽為BBB靶向基團,制備了多功能的納米材料,開展了生物成像分析(圖4)。根據(jù)所獲得的PET信號,與未修飾多肽的納米材料相比,神經(jīng)肽修飾的納米材料的BBB穿透能力增加了3倍,顯示了其在腦成像研究中的應用前景。

        將疾病特征的生理信號作為刺激,誘導影像信號的產(chǎn)生,可用于區(qū)分正常組織和病變組織,在術(shù)中病變組織的準確切除中具有重要的指導意義。Gao等[39]根據(jù)腦腫瘤區(qū)別于正常組織的酸性微環(huán)境,構(gòu)建了酸刺激響應的NMRi和表面增強拉曼(Surface?enhanced resonance Raman spectroscopy, SERRS)雙模態(tài)成像系統(tǒng),用于指導腦腫瘤手術(shù)。他們設計了兩種表面修飾Angiopep2多肽的金納米顆粒Au?AZ和Au?AK。在多肽與受體的相互作用下,Au?AZ和Au?AK穿透BBB進入腦組織; 腦腫瘤組織中的Au?AZ和Au?AK脫去表面保護層,暴露出可發(fā)生點擊反應的官能團而交聯(lián)聚集,使NMRi和SERRS信號均得到增強; 在正常組織中則不會發(fā)生這種現(xiàn)象。利用刺激響應的雙模態(tài)成像系統(tǒng),明確區(qū)分了腦腫瘤和正常腦組織的邊界,為手術(shù)的成功提供了保障。

        4.2?基于BBB靶向多肽的熒光成像分析方法

        熒光成像技術(shù)以其高分辨率、高靈敏度的特點成為研究的熱點,在腦神經(jīng)系統(tǒng)分子事件的監(jiān)測、情感的分子基礎(chǔ)研究和疾病診斷中發(fā)揮了重要作用[14,64,65]。通過共價或非共價的方式將多肽與熒光染料或納米顆粒進行偶聯(lián),可利用熒光成像可視化地篩查所設計的多肽是否定位至腦組織。 Fadzen等[66]設計并預測了具有全氟芳烴結(jié)構(gòu)的大環(huán)多肽是一種新型的BBB轉(zhuǎn)運肽, 利用Click反應對多肽進行熒光標記,分別在細胞球和動物模型層面通過熒光成像分析,直接觀測到環(huán)肽的細胞穿透和BBB運輸能力(圖5A)。另一方面,利用BBB轉(zhuǎn)運多肽可使熒光試劑靶向轉(zhuǎn)運與高效富集到腦組織,對生理病理過程進行監(jiān)測。 Cai等[67]利用聚集誘導發(fā)光染料(Aggregation induced emission, AIE)信號可控、 可提高檢測的靈敏度和信噪比的特點,以靶向多肽為識別元件,構(gòu)建了多肽功能化的AIE自組裝納米材料,實現(xiàn)了腦部腫瘤的熒光原位成像檢測,準確鑒別出了病變組織的邊界,在疾病診療中具有廣闊的應用前景。

        將具有不同目標靶向的多肽組裝于一個體系可提高轉(zhuǎn)運的特異性,從而用于特定生理病理現(xiàn)象的高選擇性成像分析。Zhao等[68]將分別靶向TfR和缺血的多肽修飾于脂質(zhì)體,發(fā)現(xiàn)多肽修飾可增加腦毛細血管內(nèi)皮細胞(BCEC cells)對脂質(zhì)體的攝入; 對雙靶向多肽修飾的脂質(zhì)體進行熒光標記,利用ex vivo熒光成像觀測到雙靶向多肽修飾的脂質(zhì)體在大腦缺血區(qū)域的特異性富集,實現(xiàn)了高特異性的主動運輸。最近,Israel等[69]將4種具有不同靶向的多肽以排列組合的方式組裝到可生物降解的聚合物(P)納米顆粒表面,P骨架修飾羅丹明(rh)熒光分子后,通過光學成像的方式考察不同多肽修飾的P對BBB的穿透能力、在不同腦區(qū)的生物分布以及動力學過程。他們發(fā)現(xiàn)修飾有BBB轉(zhuǎn)運肽AP2和內(nèi)涵體逃逸肽的P/LLL/AP2/rh在尾靜脈注射30 min后,在皮質(zhì)層、中腦丘和海馬區(qū)的薄壁組織中聚集并產(chǎn)生顯著的熒光。進一步的研究表明,P/LLL/AP2/rh中AP2發(fā)揮了BBB高效的穿透作用,LLL則起到穩(wěn)定聚合物納米組裝體的作用。這種雙功能多肽的靶向組裝體在腦神經(jīng)系統(tǒng)的成像和神經(jīng)障礙分子機制解析中具有良好的應用前景。

        除了小分子外,BBB轉(zhuǎn)運肽在納米顆粒和生物大分子的運載方面也有優(yōu)異表現(xiàn)。兼具TfR靶向和抗生物降解能力的多肽在與量子點(Quantum dots, QDs)偶聯(lián)后,可將納米尺寸的QDs運至腦實質(zhì)。利用活體雙光子成像分析,觀測到無多肽修飾的“裸露QDs”被滯留在腦毛細血管內(nèi),而修飾多肽QDs則可滲透毛細血管進入大腦,顯示出主動運輸能力(圖5B)[70]。Lim等[71]從天然蛋白質(zhì)中獲得了新型多肽dNP2,利用熒光成像分析考察了dNP2的細胞和BBB穿透能力,繼而以dNP2為靶向元件運載功能蛋白質(zhì),顯示出在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病診療中的應用價值(圖5C)。

        5?總結(jié)與展望

        靶向多肽在“血”和“腦”之間架起一座橋梁,使熒光分子、顯影試劑、納米材料等跨越屏障,將不可見、不可知的分子事件和生理過程轉(zhuǎn)化為可檢測的信號,為腦神經(jīng)分析化學的發(fā)展和腦科學的深入研究提供了新工具和新技術(shù)。在得到長足發(fā)展的同時,隨著對大腦認識和轉(zhuǎn)運肽研究的深入,已有的靶標受體和多肽也不斷面臨新的挑戰(zhàn)。一些目前常用的受體分子,包括TfR、LDLR等,不僅在大腦內(nèi)皮細胞高表達,在外周病變組織也大量出現(xiàn),降低了特異性,影響靶向多肽對BBB的高特異性定位分析。此外,多肽在具有高生物相容性的同時,也可能被機體內(nèi)的水解酶降解,因此,增加其生物穩(wěn)定性也是亟需解決的問題,對于活體、原位、長時程示蹤分析具有重要意義。

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        Targeted Analysis of Central Nervous System Using

        Blood?Brain Barrier Shuttle Peptides

        HUANG Yan?Yan1,2, ZHAO Rui*1,2

        1(Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, CAS Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems,

        Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)

        2(University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

        Abstract?Targeted delivery of molecules and materials across blood?brain barrier (BBB) is critical for in?situ and real?time analysis of central nervous system, which is also a challenge for analytical chemistry. As a kind of endogenous bioactive species, peptides with modulate structure can be designed with predictable conformations and chemically synthesized with high efficiency and purity. Peptides can act as BBB shuttles to transport fluorescent dyes, contrast agents and nanomaterial to target tissues, providing new tools and analytical methods for brain science, disease detection and molecular mechanism investigation. This review summarizes recent advances in analytical applications of BBB shuttle peptides for studying central nervous system. Introduction on BBB, peptides as well as design and screening approaches of BBB shuttle peptides is also included.

        Keywords?Blood?brain barrier; Peptide; Targeted analysis; Affinity screening; Review

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