侯壯豪　詹柳娟　欒謀君　田雙雙　戴夢(mèng)杰　黃光明

摘?要?針對(duì)單細(xì)胞的代謝分析具有重要的研究?jī)r(jià)值，發(fā)展對(duì)單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的代謝物的分析技術(shù)（單個(gè)神經(jīng)元分析技術(shù)）更是研究大腦的基礎(chǔ)。由于代謝物分子種類眾多，濃度差異巨大，目前單細(xì)胞代謝分析方法主要是基于質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展起來(lái)的。利用質(zhì)譜從單個(gè)神經(jīng)元層面對(duì)代謝物開展研究，有助于揭示神經(jīng)元的異質(zhì)性，為探索神經(jīng)元工作機(jī)制、研究神經(jīng)元代謝活動(dòng)以及針對(duì)重大腦疾病開發(fā)新療法提供新的研究工具。本文對(duì)近年來(lái)對(duì)單細(xì)胞代謝物的質(zhì)譜分析新方法進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)述，從離體培養(yǎng)的神經(jīng)元、新鮮分離的神經(jīng)元和組織原位的神經(jīng)元等方面介紹了單細(xì)胞質(zhì)譜分析技術(shù)在單個(gè)神經(jīng)元分析中的應(yīng)用，并從質(zhì)譜儀器技術(shù)的開發(fā)、新分析方法的發(fā)展和生物研究應(yīng)用3個(gè)方面對(duì)單個(gè)神經(jīng)元的質(zhì)譜代謝分析的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞?單個(gè)神經(jīng)元分析; 代謝物分析; 單細(xì)胞質(zhì)譜; 評(píng)述

1?引 言

細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單元，分析和檢測(cè)細(xì)胞生命過(guò)程中各種化學(xué)物質(zhì)的變化，可以為藥物開發(fā)、病理探討、細(xì)胞毒性等重大生物醫(yī)學(xué)問(wèn)題提供理論指導(dǎo)，具有重要的科學(xué)價(jià)值。作為神經(jīng)系統(tǒng)的基本單元，神經(jīng)元的研究技術(shù)（尤其是單個(gè)神經(jīng)元分析技術(shù)）是研究大腦的基礎(chǔ)。神經(jīng)元內(nèi)的小分子代謝物是神經(jīng)元正常工作的基礎(chǔ)，可介導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)的傳遞，或?qū)χ袠猩窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控，具有非常重要的生理功能。由于細(xì)胞異質(zhì)性，不同的代謝物質(zhì)在不同類型的神經(jīng)元內(nèi)的分布和功能均不相同; 在不同類型的神經(jīng)元中，同一種化學(xué)物質(zhì)的含量也并不相同，產(chǎn)生的生理作用也大相徑庭。目前，由于相關(guān)技術(shù)的種種局限，對(duì)于這些相關(guān)內(nèi)容的研究大多得到多個(gè)細(xì)胞的平均信號(hào)，對(duì)于單個(gè)神經(jīng)元（Single neuron）內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的了解僅限于某幾種特殊化合物，對(duì)于單個(gè)活體神經(jīng)元的研究則更加有限。

單個(gè)神經(jīng)元質(zhì)譜分析的主要技術(shù)難點(diǎn)在于：細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)種類多，濃度分布跨度大，且存在大量無(wú)機(jī)鹽干擾; 單細(xì)胞體積小，細(xì)胞僅有皮升級(jí)的體積，常規(guī)質(zhì)譜儀器以及分析方法均無(wú)法勝任。種種困難限制了對(duì)單個(gè)神經(jīng)元的深入研究，單個(gè)神經(jīng)元的代謝分析無(wú)論從相關(guān)分析技術(shù)的發(fā)展還是研究?jī)r(jià)值都長(zhǎng)期被低估。

近年來(lái)，基于各種放大技術(shù)的單細(xì)胞基因組及轉(zhuǎn)錄組的研究得到了飛速發(fā)展，神經(jīng)元細(xì)胞的個(gè)體差異要遠(yuǎn)超過(guò)之前的認(rèn)知，單細(xì)胞的分析技術(shù)為單個(gè)神經(jīng)元生命活動(dòng)研究開辟了新的途徑，有望為重大生物醫(yī)學(xué)問(wèn)題提供新的解決方法與思路，為探索人類神經(jīng)元工作機(jī)制，以及針對(duì)重大腦疾病開發(fā)新療法提供新的研究工具。

近年來(lái)，單細(xì)胞尤其是單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)代謝物的研究方法得到了越來(lái)越多的重視，出現(xiàn)了一系列開拓性的研究工作。本文對(duì)近二十年來(lái)相關(guān)研究進(jìn)行了總結(jié)，著重評(píng)述單細(xì)胞代謝質(zhì)譜新技術(shù)在單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)代謝物分析中的應(yīng)用與發(fā)展。

2?早期胚胎單細(xì)胞的質(zhì)譜代謝分析

受精卵（Zygote）與早期胚胎（Embryos）中單細(xì)胞體積大，是眾多單細(xì)胞分析方法重要的研究模型之一。受精卵與早期胚胎在生命體系中扮演著重要角色，其發(fā)育與分化過(guò)程中伴隨著許多物質(zhì)的快速新陳代謝，細(xì)胞間存在十分顯著的異質(zhì)性（Heterogeneity）。對(duì)受精卵與早期胚胎的單細(xì)胞層面的研究，有助于揭示細(xì)胞個(gè)體在發(fā)育分化的分子調(diào)控機(jī)制，具有重要的生物學(xué)研究?jī)r(jià)值。很多研究常采用受精卵與早期胚胎作為初始模型發(fā)展相關(guān)技術(shù)，再將新技術(shù)進(jìn)一步借鑒、拓展和延伸到細(xì)胞體積更小的單細(xì)胞模型，尤其是單個(gè)神經(jīng)元的分析。

毛細(xì)管電泳?電噴霧質(zhì)譜法（Capillary electrophoresis?electrospray ionization mass spectrometry，CE?ESIMS）具有上樣量小，靈敏度高等特點(diǎn)，適合對(duì)微量樣品進(jìn)行快速的分離分析，Nemes研究組針對(duì)蛙卵細(xì)胞開發(fā)早期胚胎單細(xì)胞微區(qū)取樣分析方法[1～5]，對(duì)8?細(xì)胞期[3，4]和16?細(xì)胞期[2]胚胎中不同種類的胚胎單細(xì)胞進(jìn)行代謝物異質(zhì)性研究，發(fā)現(xiàn)小分子代謝會(huì)對(duì)細(xì)胞亞型的發(fā)育產(chǎn)生重要的影響，部分物質(zhì)如Asparagine， Glycine和Betaine在不同細(xì)胞間存在顯著性差異，并利用單細(xì)胞中測(cè)得的氨基酸等70多種代謝物的信號(hào)強(qiáng)度、保留時(shí)間等信息實(shí)現(xiàn)了8?細(xì)胞期胚胎中腹部和背部細(xì)胞亞型的主成分分析（Principal component analysis，PCA）分型。

光電離質(zhì)譜技術(shù)由于其使用的激光光斑較小，有利于進(jìn)行單細(xì)胞分析。利用激光剝蝕輔助的電噴霧（Laser ablation electrospray ionization， LAESI）[6，7]、基質(zhì)輔助激光解吸附電噴霧（Matrix?assisted laser desorption/ionization electrospray， MALDI）[8]和真空紫外光電離（Vacuum ultraviolet laser desorption/ionization，VUVDI）[9]能夠高效地實(shí)現(xiàn)受精卵早期胚胎的代謝物及磷脂成像分析[6，7，9]和三維成像[8]。

此外，解吸附電噴霧質(zhì)譜（Desorption electrospray ionization mass spectrometry，DESI）也被用于研究卵母細(xì)胞[10]和胚胎單細(xì)胞[11]的代謝及其細(xì)胞亞型的分型。

3?培養(yǎng)單細(xì)胞的質(zhì)譜代謝分析

對(duì)組織中的特定細(xì)胞分離后進(jìn)行原代培養(yǎng)或傳代，通過(guò)培養(yǎng)液模擬生物環(huán)境，可以使細(xì)胞功能和進(jìn)程的研究更具可操作性。培養(yǎng)的細(xì)胞易于施用物理、化學(xué)和生物手段進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)，便于與現(xiàn)有的分析技術(shù)結(jié)合，在細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)等方面的研究中都發(fā)揮著重要的作用。對(duì)單個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng)與質(zhì)譜單細(xì)胞代謝分析，可以有針對(duì)性地研究神經(jīng)元內(nèi)物質(zhì)的變化、神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，進(jìn)而研究神經(jīng)元功能的分子作用機(jī)制，為神經(jīng)元的疾病診治提供研究基礎(chǔ)。

目前， 針對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞（Cultured cells）已發(fā)展出了許多高效的單細(xì)胞代謝技術(shù)，其分析技術(shù)對(duì)單個(gè)神經(jīng)元的研究也起著重要的啟示作用。

3.1?電噴霧離子化質(zhì)譜

為了實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞微量胞漿的分析，Masujima研究組采取毛細(xì)管取樣后，在噴針后端補(bǔ)充溶劑的方式，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的代謝物檢測(cè)[12]，并將真皮細(xì)胞中肥大細(xì)胞的胞漿和顆粒、實(shí)驗(yàn)溶劑、培養(yǎng)基的質(zhì)譜譜圖直接導(dǎo)入數(shù)據(jù)處理軟件，利用主成分分析能夠有效地將溶劑、培養(yǎng)基的譜圖與肥大細(xì)胞的數(shù)據(jù)區(qū)分（圖1A） [13]，并使用毛細(xì)管針對(duì)單細(xì)胞取樣后施加超聲波， 實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)代謝物的快速釋放與萃取[14]。此外，為了進(jìn)一步研究單細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)，他們對(duì)HepG2細(xì)胞不同細(xì)胞期進(jìn)行微區(qū)取樣[13]，實(shí)現(xiàn)微區(qū)代謝物的檢測(cè)。Vertes研究組利用毛細(xì)管取樣針對(duì)貼壁的HepG2進(jìn)行取樣與離子化，結(jié)合離子遷移譜過(guò)濾干擾信號(hào)，研究HepG2細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換、氧化還原和代謝轉(zhuǎn)化的代謝物[15]，采用正交校正的偏最小二乘分析（Orthogonal partial least squares?discriminant analysis， OPLS?DA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞周期的分型（圖1B）[16]。而Hui研究組對(duì)單細(xì)胞中亞結(jié)構(gòu)的脂滴取樣，進(jìn)行甘油三酸酯（Triglycerides，TG）和磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholines，PC）的萃取離子化，發(fā)現(xiàn)不同處理?xiàng)l件下TG和PC的成分會(huì)發(fā)生顯著的變化[17]。

Zhang研究組將單細(xì)胞分散于微孔板中，加入萃取劑實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞中代謝物的萃取，利用納升電噴霧質(zhì)譜對(duì)細(xì)胞內(nèi)磷酸化葡萄糖進(jìn)行定量分析[18]; 為了提高單細(xì)胞分析的通量，該研究組提出了流式電噴霧技術(shù)（Flow cytometry ESI?MS， CyESI?MS， 圖2A）[19]，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高通量分析，并利用t分布隨機(jī)鄰域嵌入分析（T?distributed stochastic neighbor embedding，t?sne）實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞亞型的分型。為了進(jìn)一步去除基質(zhì)干擾，提高信號(hào)靈敏度，液滴微萃取[20，21]、微孔陣列萃取[22]、多級(jí)微萃取[23]和毛細(xì)管電泳等電聚焦[24]等技術(shù)被開發(fā)并應(yīng)用于單細(xì)胞基質(zhì)清除與代謝物富集，提高分析靈敏度，同時(shí)實(shí)現(xiàn)高通量單細(xì)胞分析[20～22]及單細(xì)胞亞型的分型[23]。

Lin研究組開發(fā)了基于微流控的噴墨打印技術(shù)（Drop?on?demand inkjet printing，圖2B）[25]和迪恩流有序化單細(xì)胞分離技術(shù)（Dean flow assisted cell ordering system）[26]，實(shí)現(xiàn)懸浮細(xì)胞的單細(xì)胞分離與進(jìn)樣，與電噴霧結(jié)合實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)代謝物的檢測(cè)，并對(duì)細(xì)胞的脂質(zhì)進(jìn)行PCA分析，實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞的分型。

Yang研究組發(fā)展了一種用雙通道毛細(xì)管取樣針進(jìn)行原位微區(qū)物質(zhì)萃取與離子化的單探針?電噴霧技術(shù)（Single?probe ESI，圖3A），能夠?qū)崿F(xiàn)懸浮HeLa單細(xì)胞[27，30，31]、藻類單細(xì)胞[32]等的代謝物及磷脂類物質(zhì)的分析檢測(cè)。該研究組將這種高效的技術(shù)成功運(yùn)用到細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞的藥物研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞不飽和脂肪酸的水平要比非癌癥干細(xì)胞的水平高，且抑制細(xì)胞內(nèi)一些相關(guān)酶的活性能夠有效降低不飽和脂肪酸的含量，能防止形成腫瘤球體[33]。結(jié)合在線衍生的方式[34]，實(shí)現(xiàn)對(duì)HeLa單細(xì)胞內(nèi)代謝物的化學(xué)衍生，轉(zhuǎn)換成容易離子化的形式，進(jìn)一步提高細(xì)胞內(nèi)代謝物的檢測(cè)種類。此外，該研究組對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入研究與挖掘，利用機(jī)器學(xué)習(xí)、主成分分析等對(duì)白血病單細(xì)胞[35]進(jìn)行細(xì)胞分型以及耐藥性癌細(xì)胞表型預(yù)測(cè)[36，37]。

3.2?二次離子質(zhì)譜

Sheng等[28]采用15N標(biāo)記的氨基酸培養(yǎng)細(xì)胞， 并利用二次離子質(zhì)譜（Secondary ion mass spectrometry，SIMS）對(duì)蛋白進(jìn)行分析（圖3B），利用蛋白質(zhì)的特征碎片，實(shí)現(xiàn)15N氨基酸在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化定位。為了提高SIMS分析靈敏度，Long研究組將金屬納米層[38]、石墨烯量子點(diǎn)[39]作為新的基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞脂質(zhì)體高靈敏度成像分析，并研究了銀納米粒子的攝入對(duì)細(xì)胞表面脂質(zhì)的影響（圖3C）[29]。

3.3?激光解吸附離子化質(zhì)譜

Vertes研究組用LAESI 對(duì)HepG2貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞進(jìn)行代謝物分析，發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞腺苷酸能荷值遠(yuǎn)高于懸浮細(xì)胞（圖4A）[40]; 該研究組還對(duì)光電離（LDI）開發(fā)了新型的納米陣列基質(zhì)，提高激光解離的光離子化效率，成功提高了酵母細(xì)胞內(nèi)代謝物的分析能力[41，42]。Wang等[43]開發(fā)了VUVDI， 實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞內(nèi)弱極性代謝物的軟電離亞微米成像。 Hang研究組則開發(fā)了近場(chǎng)解吸附質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)了貼壁單細(xì)胞的形貌及代謝物的分布的同時(shí)分析[44]，以及飛秒激光離子化技術(shù)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)元素分析[45]。

將培養(yǎng)的細(xì)胞分散于MALDI的樣品板上，結(jié)合微區(qū)分析技術(shù)，能夠很便捷地實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞中代謝物的分析[47～49]。為了提高單細(xì)胞代謝分析的通量，Zenobi研究組發(fā)展了高密度微陣列芯片?MALDI技術(shù)（圖4B）對(duì)綠藻單細(xì)胞[46，50]、酵母單細(xì)胞[51]和HeLa單細(xì)胞[52]進(jìn)行代謝物分析，側(cè)重研究單細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換相關(guān)的代謝物（ATP/ADP）及其轉(zhuǎn)換過(guò)程。為了對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多維度的分析，獲得單細(xì)胞的多層次信息，該研究組在MALDI與光譜學(xué)方法聯(lián)用技術(shù)上進(jìn)行了開拓，發(fā)展了拉曼和熒光與高密度微陣列MALDI質(zhì)譜?聯(lián)用[53]和光學(xué)?拉曼?熒光?MALDI聯(lián)用[54]對(duì)綠藻單細(xì)胞生長(zhǎng)狀況進(jìn)行多維度監(jiān)測(cè)。

與普通的單細(xì)胞模型如HeLa，HepG2等細(xì)胞不同，神經(jīng)元除了有較大的胞體外，還存在直徑小于1 μm的突觸結(jié)構(gòu)，為了研究體外培養(yǎng)神經(jīng)元（Cultured neurons）及亞結(jié)構(gòu)，須開發(fā)分辨率、取樣精度更高的方法，以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元的微區(qū)分析。Sweedler研究組利用 SIMS實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)的單個(gè)神經(jīng)元亞結(jié)構(gòu)內(nèi)代謝物的成像分析[55]。將MALDI與免疫組化[56]、SIMS[57]等技術(shù)結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)脂質(zhì)和低豐度的代謝物的分析。

Xu等[58]組利用電化學(xué)泵產(chǎn)生電滲流，用130 nm的毛細(xì)管針作為取樣針與噴針，實(shí)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞的軸突和樹突的代謝物分析，發(fā)現(xiàn)谷氨酸和焦谷氨酸在軸突處的濃度要高于胞體和樹突。

4?新鮮分離單細(xì)胞的質(zhì)譜代謝分析

細(xì)胞培養(yǎng)能夠在一定程度上模擬體內(nèi)環(huán)境，使細(xì)胞生存、生長(zhǎng)， 并維持主要的結(jié)構(gòu)與功能，但是由于其存在環(huán)境與真實(shí)體內(nèi)環(huán)境存在一些差異，細(xì)胞離體后部分功能與活性會(huì)受到抑制甚至消失。因此， 對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞獲得的一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一定能真實(shí)地反映體內(nèi)的情況。

神經(jīng)元雖然能夠在體外培養(yǎng)中存活與生長(zhǎng)，但Nemes等[59]利用毛細(xì)管電泳對(duì)新鮮分離的神經(jīng)元與培養(yǎng)的神經(jīng)元內(nèi)代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)環(huán)境不同，部分類型的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)代謝物改變較大。盡可能地接近真實(shí)細(xì)胞的存在狀態(tài)，才最能反映細(xì)胞內(nèi)實(shí)際的代謝狀況。因此針對(duì)新鮮分離的單個(gè)神經(jīng)元（Freshly isolated single neuron）進(jìn)行代謝物分析，才能更為真實(shí)地反映單細(xì)胞內(nèi)的代謝物分布情況。

Passarelli等[60]利用C61SIMS對(duì)海蝸牛神經(jīng)元內(nèi)脂質(zhì)進(jìn)行表征與成像，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元表面脂質(zhì)的分布存在異質(zhì)性。此外，Zhang等[61]結(jié)合離子遷移譜IMS?ESI，利用多肽與代謝物在離子遷移譜的漂移時(shí)間差異，提高神經(jīng)肽信號(hào)的分析靈敏度，實(shí)現(xiàn)離體單個(gè)神經(jīng)元中神經(jīng)肽的分析。

Sweedler的研究組利用毛細(xì)管電泳?電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析了海蝸牛離體神經(jīng)元[62，63]及其亞結(jié)構(gòu)[64]中的代謝物，并根據(jù)代謝物的差異，用PCA實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元亞型的分型（圖5A）[62]。他們嘗試將多種神經(jīng)元分散于MALDI基板上，噴涂基質(zhì)后對(duì)其進(jìn)行分析，能夠同時(shí)檢測(cè)神經(jīng)元中的代謝物，并利用PCA實(shí)現(xiàn)了稀有細(xì)胞腦垂體細(xì)胞、胰島細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的分型[65]。該研究組實(shí)現(xiàn)了對(duì)海蝸牛離體神經(jīng)元[66]和離體大鼠神經(jīng)元[67]寡肽的分析。該研究組利用MALDI大規(guī)模分析了30000個(gè)神經(jīng)元內(nèi)脂質(zhì)的信號(hào)（圖5B），并運(yùn)用t?sne實(shí)現(xiàn)不同亞型的細(xì)胞的分型[68]。

此外， Jarecki等[69]利用MALDI也實(shí)現(xiàn)了離體單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)肽的發(fā)現(xiàn)及定位; Li研究組將Microcolumn LC與MALDI結(jié)合實(shí)現(xiàn)離體單個(gè)神經(jīng)元的寡肽分離與定性分析[70，71]; Neupert等[72]利用 MALDI對(duì)組織美洲大蠊單個(gè)神經(jīng)元實(shí)現(xiàn)了一些寡肽的分析。

5?原位組織上單細(xì)胞的質(zhì)譜代謝分析

細(xì)胞一旦離開組織環(huán)境，細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的供給方式、細(xì)胞間的接觸交流都會(huì)發(fā)生巨大改變，并且會(huì)伴隨著很大程度的細(xì)胞生理應(yīng)激。特別是單個(gè)神經(jīng)元與神經(jīng)元細(xì)胞之間通過(guò)突觸相連，離體之后無(wú)法進(jìn)行重要的神經(jīng)活動(dòng)，也就無(wú)法完整地獲得細(xì)胞的真實(shí)狀態(tài)。因此，為了真實(shí)地反映神經(jīng)元的狀態(tài)，在組織上直接原位分析單細(xì)胞代謝顯得尤為重要。

Masujima研究組采用毛細(xì)管噴針直接對(duì)植物葉片[73，74]、花瓣[75]等單細(xì)胞取樣后進(jìn)行ESI分析，能夠原位獲得植物單細(xì)胞中代謝物信息。Nonami的研究組利用電噴霧技術(shù)對(duì)[76，77]植物葉片進(jìn)行了原位單細(xì)胞分析。Vertes研究組利用LAESI技術(shù)針對(duì)植物組織細(xì)胞如洋蔥細(xì)胞[78～81]、葉片[82，83]等進(jìn)行了單細(xì)胞及其亞細(xì)胞器分析，并利用Post hoc grouping、OPLS?DA等數(shù)據(jù)處理方法，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)許多代謝物的豐度在不同細(xì)胞群體內(nèi)分布不一樣。 Zhao等[84]采用氫火焰離子化質(zhì)譜對(duì)植物葉子單細(xì)胞取樣并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)代謝物的檢測(cè)。 Zhang的研究組利用固相微萃取[85]、衍生[86]的方式針對(duì)性地提高植物細(xì)胞及其亞細(xì)胞器中特定代謝物（如糖類）的分析靈敏度。

Merrill等[87]用膜片鉗原位監(jiān)測(cè)單個(gè)神經(jīng)元，取樣后用Nanoflow LC進(jìn)行脂質(zhì)的分析，鑒定出40余種脂質(zhì)，并且對(duì)不同刺激條件下的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行PCA分型; Neupert等[88]結(jié)合膜片鉗?MALDI實(shí)現(xiàn)原位美洲大蠊單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)電生理信號(hào)與代謝物的成像。

Aerts等[89]采用膜片鉗與毛細(xì)管電泳質(zhì)譜結(jié)合的方式（Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis?mass spectrometry）實(shí)現(xiàn)了原位活體單個(gè)神經(jīng)元的生理信號(hào)及代謝物的同時(shí)分析（圖6）。通過(guò)對(duì)γ?氨基丁酸能神經(jīng)元（Gamma?aminobutyri acid?ergic neurons）和谷氨酸能神經(jīng)元（Glutamatergic neurons）的研究，在谷氨酸能神經(jīng)元的胞漿中檢測(cè)到60種代謝物，但沒(méi)有出現(xiàn)GABA，而在單個(gè)γ?氨基丁酸能神經(jīng)元的胞漿中能夠測(cè)到GABA的信號(hào)，進(jìn)一步證實(shí)腦區(qū)中神經(jīng)元的異質(zhì)性。這種方法能夠很好地實(shí)現(xiàn)單個(gè)神經(jīng)元的神經(jīng)化學(xué)狀態(tài)與細(xì)胞生理活性的同時(shí)關(guān)聯(lián)監(jiān)測(cè)。

Huang研究組和Xiong研究組合作，通過(guò)單細(xì)胞膜片鉗和納升電噴霧噴針對(duì)單細(xì)胞內(nèi)液進(jìn)行采樣; 利用感應(yīng)電噴霧特殊的離子化過(guò)程[92～94]，對(duì)體系較復(fù)雜的神經(jīng)元中的神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行原位分離與檢測(cè)，檢測(cè)出50余種代謝物（圖7A）， 從單細(xì)胞層次，比較了不同腦區(qū)神經(jīng)元之間的組分區(qū)別，觀察到了在年齡、變異等生理過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)組分的變化，并用于研究單個(gè)神經(jīng)元中物質(zhì)的代謝途徑[90]。他們利用原位質(zhì)譜技術(shù)對(duì)神經(jīng)元中的其它代謝路徑進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了一些在細(xì)胞勻漿體系中尚未檢測(cè)到的代謝路徑（圖7B）[91]。結(jié)合動(dòng)物行為學(xué)試驗(yàn)，揭示了紫外線調(diào)控學(xué)習(xí)認(rèn)知功能的分子機(jī)制。以上發(fā)現(xiàn)是對(duì)常規(guī)分析方法的結(jié)果的重要補(bǔ)充，揭示了活體單細(xì)胞原位質(zhì)譜分析可從單細(xì)胞層次對(duì)一些生命科學(xué)中的重大科學(xué)問(wèn)題進(jìn)行再次深入的闡釋。

6?展 望

單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)代謝物的質(zhì)譜分析在過(guò)去的十余年里取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但目前將質(zhì)譜分析應(yīng)用于單個(gè)神經(jīng)元的代謝研究仍存在諸多局限，還需要從儀器改造、分析方法以及應(yīng)用研究多個(gè)方面展開深入研究。

由于神經(jīng)元內(nèi)物質(zhì)種類眾多，濃度分布跨度大，且存在大量的無(wú)機(jī)鹽成分干擾，需要從根本上提高質(zhì)譜儀器的絕對(duì)靈敏度。比如借助多級(jí)離子累積技術(shù)[95]，有望將被稀釋的代謝物重新富集出來(lái)，在質(zhì)譜中獲得響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)單個(gè)神經(jīng)元中低豐度物質(zhì)的檢測(cè)分析。另外，將質(zhì)譜與離子遷移譜[16，63]等快速分離的技術(shù)耦合，也有望進(jìn)一步降低質(zhì)譜檢測(cè)中化學(xué)噪音的干擾，提高代謝物在質(zhì)譜中的信噪比。此外，對(duì)單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)目前難以檢測(cè)的弱極性和非極性物質(zhì)，需要通過(guò)質(zhì)譜離子源的開發(fā)，例如結(jié)合光電離[96]、質(zhì)譜光解離[97，98]、分子?離子反應(yīng)[99，100]等技術(shù)，提高單個(gè)神經(jīng)元層次的分析靈敏度。

單細(xì)胞/單個(gè)神經(jīng)元分析最終的研究目標(biāo)是研究其生物功能，因而開發(fā)生物兼容更好（獲得單個(gè)細(xì)胞更加接近組織環(huán)境的信息）的分析技術(shù)顯得尤為重要。目前的單個(gè)神經(jīng)元分析常需要進(jìn)行毛細(xì)管電泳等分離操作，導(dǎo)致單個(gè)神經(jīng)元的分析通量受到極大的限制。因此聯(lián)合自動(dòng)化操作技術(shù)，或者借鑒流式細(xì)胞儀質(zhì)譜的思路[19，101～106]，降低單個(gè)細(xì)胞的質(zhì)譜分析時(shí)間，才有望提高單個(gè)神經(jīng)元分析的通量，為單個(gè)神經(jīng)元的異質(zhì)性研究提供更加豐富的數(shù)據(jù)。此外，對(duì)于質(zhì)譜信號(hào)極差的低豐度的物質(zhì)，可以通過(guò)細(xì)胞環(huán)境原位衍生等方法將代謝物轉(zhuǎn)化成容易離子化的信號(hào)[86，107]，有望進(jìn)一步擴(kuò)展單個(gè)神經(jīng)元在質(zhì)譜分析中的代謝物覆蓋度。

“腦計(jì)劃”目前是世界生物醫(yī)學(xué)的重大課題之一，是繼人類基因組計(jì)劃之后另一個(gè)宏偉的科學(xué)研究計(jì)劃，研究大腦基本單元?神經(jīng)元的技術(shù)（單個(gè)神經(jīng)元分析技術(shù)）是研究大腦的基礎(chǔ)。針對(duì)單個(gè)神經(jīng)元的代謝分析技術(shù)， 研究者已經(jīng)積累了許多高效的技術(shù)手段和工具，但絕大多數(shù)的研究仍集中在離體的單個(gè)神經(jīng)元的質(zhì)譜新技術(shù)開發(fā)上，針對(duì)組織上單個(gè)神經(jīng)元的原位分析技術(shù)也存在影響細(xì)胞活性的問(wèn)題。針對(duì)單個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行原位無(wú)損的代謝物分析，對(duì)質(zhì)譜學(xué)研究也提出了極大的挑戰(zhàn)。只有實(shí)現(xiàn)單個(gè)神經(jīng)元的無(wú)損原位分析，才能與記錄腦活動(dòng)的電化學(xué)檢測(cè)方法耦聯(lián)，實(shí)現(xiàn)在微觀/時(shí)間分辨層面開展長(zhǎng)程神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)、認(rèn)知過(guò)程中神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化和信息處理機(jī)制、以及環(huán)路結(jié)構(gòu)和功能可塑性的研究。

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Metabolites Analysis of Single Cell by Mass Spectrometry

and Application in Single Neuron Metabolites Analysis

HOU Zhuang?Hao， ZHAN Liu?Juan， LUAN Mou?Jun， TIAN Shuang?Shuang，

DAI Meng?Jie， HUANG Guang?Ming*

（Department of Chemistry， School of Chemistry and Materials Science，

University of Science and Technology of China， Hefei 230026， China）

Abstract?Single?cell assays has emerged as a cutting?edge technique during the past decade. Despite several issues （including pL volume， extremely complicated intracellular fluid and maintaining cell viability during sampling） still need to be addressed， single?cell mass spectrometry for metabolites has achieved remarkable results recently. Various mass spectrometry?based approaches have enabled identification of vast cytoplasmic chemical constituents at single cell level， which greatly facilitate the single neuron analysis at different physiological conditions. In this review， we have concluded recent single?cell mass spectrometry investigations toward single neuron analysis， including single ovum/zygote， single cultured cell， single freshly isolated cell and single cell/neuron on tissue.

Keywords?Single neuron analysis; Metabolites analysis; Single cell mass spectrometry; Review