江麗娜 穆成 孫蕊 王志銳 戴文汐 王春花

結(jié)核病作為單一感染源的全球十大致死疾病之一，目前因其死亡的患者例數(shù)已經(jīng)超過艾滋病[1]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO) 報(bào)告指出，2017年全球大概有1000萬例結(jié)核病患者，單耐利福平患者55.8萬例，其中82%為耐多藥肺結(jié)核(MDR-PTB)，約50%的MDR-PTB患者集中在印度(24%)、中國(13%)、俄羅斯(10%)[1]。MDR-TB已經(jīng)迅速發(fā)展為全球重要的公共健康問題，特別是在發(fā)展中國家，給傳染病的預(yù)防和控制帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

及早發(fā)現(xiàn)和治療MDR-TB對有效控制及遏制結(jié)核病的傳播和預(yù)防起著重要的作用[2]。一直以來，表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“比例法藥敏試驗(yàn)”)是抗結(jié)核藥物耐藥性檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但是長達(dá)幾周至2個(gè)月的檢測時(shí)間嚴(yán)重影響了臨床診斷和治療。故而基因型分子藥敏試驗(yàn)檢測技術(shù)快速發(fā)展起來。2008年，WHO推薦可以應(yīng)用分子線性探針技術(shù)作為快速檢測MDR-TB的手段[3]。GenoType?MTBDRplus assay是德國Hain公司研發(fā)的已被臨床廣泛應(yīng)用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及其對利福平和異煙肼耐藥性，以及識別耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)的分子生物學(xué)技術(shù)[4]。2012年Hain公司在原有基礎(chǔ)上改進(jìn)研發(fā)了GenoType MTBDRplus VER 2.0(簡稱“GenoType 2.0”)，較GenoType?MTBDRplus assay具有更高的敏感度和特異度，在臨床及全球結(jié)核病疫情嚴(yán)重地區(qū)被大力推廣[3-4]。為了解GenoType 2.0的檢測效能，天津結(jié)核病控制中心參比實(shí)驗(yàn)室使用GenoType 2.0試劑盒檢測培養(yǎng)陽性菌株，并與比例法藥敏試驗(yàn)進(jìn)行檢測效能比較，為該技術(shù)的應(yīng)用提供一定參考。

材料和方法

一、研究材料

1.樣本來源：收集2017年4月至2019年4月天津市結(jié)核病控制中心參比實(shí)驗(yàn)室中疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本共6315份，對其中412份痰涂片陽性標(biāo)本行BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)，排除39份培養(yǎng)陰性標(biāo)本；對373株培養(yǎng)陽性菌株進(jìn)行菌種鑒定，排除23株經(jīng)鑒定為非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)、1株培養(yǎng)陽性但GenoType 2.0無法判讀的菌株，將鑒定為結(jié)核分枝桿菌(MTB)的349株菌株作為研究對象，分別采用比例法藥敏試驗(yàn)和GenoType 2.0檢測其對利福平、異煙肼的耐藥性，比較比例法藥敏試驗(yàn)、GenoType 2.0，以及GenoType 2.0+比例法檢測情況，其中GenoType 2.0+比例法的耐藥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以其中任一方法耐藥即判定為“耐藥”。并以比例法為標(biāo)準(zhǔn)，分析GenoType 2.0的檢測效能和GenoType 2.0檢測的突變基因分布情況。

2.試劑及設(shè)備：GenoType 2.0試劑盒(德國HAIN Lifescience公司)；BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；線性探針耐多藥檢測設(shè)備GTblot-20全自動雜交儀(德國HAIN Lifescience公司)；超聲儀D-78224(德國Elma 公司)；基因擴(kuò)增儀Ag-22331(德國 Eppendorf 公司)；低溫離心機(jī)5430R(德國Eppendorf公司)；恒溫金屬浴D-91052(德國PEQLAB公司)。

二、菌種鑒定和比例法藥敏試驗(yàn)

使用硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基對373株培養(yǎng)陽性的菌株進(jìn)行菌種鑒定。根據(jù)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]，按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化程序，分別采用含利福平40 μg/ml、異煙肼0.2 μg/ml的培養(yǎng)基按照WHO推薦的比例法藥敏試驗(yàn)進(jìn)行菌株耐藥性檢測及結(jié)果判定[6-7]。

三、GenoType 2.0檢測

本實(shí)驗(yàn)基于多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過反向雜交技術(shù)與預(yù)先固化在試紙條上的特異性探針雜交，通過雜交條帶的顯色情況來判定MTB對利福平和異煙肼的耐藥性?；诰€性探針方法條帶技術(shù)，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，步驟包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的基因組提取、生物素標(biāo)記引物的PCR擴(kuò)增、反向雜交三部分。實(shí)驗(yàn)檢測的3個(gè)突變基因分別為：rpoB為利福平耐藥；inhA為異煙肼低水平耐藥；katG為異煙肼高水平耐藥，在雜交帶上3個(gè)基因的野生型和突變型均可以體現(xiàn)。每個(gè)標(biāo)本需要1個(gè)探針試條，每個(gè)探針試條有27個(gè)反應(yīng)區(qū)，包括標(biāo)記物質(zhì)量控制(簡稱“質(zhì)控”，CC)、 擴(kuò)增質(zhì)控(AC)、 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(TUB)、野生型和突變型探針。

1.核酸提取與PCR擴(kuò)增：DNA提取試劑盒GenoLyse?kit包括裂解液(LA-LYS) 與中和緩沖液(A-NB)。每個(gè)菌株取1平環(huán)菌落放入含100 μl裂解液的1.5 ml離心管中，振蕩混勻。將懸浮液 放于95 ℃金屬浴滅活5 min，短暫離心后(離心半徑為10 cm，3000 r/min 離心30 s)，加入100 μl的中和緩沖液，振蕩5 s后混勻。再采用離心半徑為10 cm，14 000 r/min 離心5 min 后轉(zhuǎn)移上清至另一1.5 ml離心管，用于擴(kuò)增。擴(kuò)增體系50 μl：由10 μl的AM-A 試劑(包括10×PCR緩沖液，4種核苷酸，DNA擴(kuò)增酶)、35 μl的AM-B試劑(包括MgCl2，生物素標(biāo)記的引物和染液)和5 μl提取的基因組模板組成。擴(kuò)增條件：95 ℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，65 ℃ 2 min，10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 25 s，50 ℃ 40 s，70 ℃ 40 s，20個(gè)循環(huán)；70 ℃ 8 min，1個(gè)循環(huán)；4 ℃ 保存。

2.反向雜交檢測：雜交反應(yīng)在預(yù)熱的GTblot-20全自動雜交儀上進(jìn)行。使用前，45 ℃預(yù)熱雜交緩沖液(HYB)和嚴(yán)格漂洗液(STR)直至溶液沒有結(jié)晶。分別取20 μl PCR產(chǎn)物與20 μl分離試劑混合，加入雜交盤，室溫變性5 min。分別謹(jǐn)慎加入帶有探針的測試條，并將雜交盤放入已經(jīng)預(yù)熱的GTblot-20全自動雜交儀，進(jìn)行雜交及顯色。其余步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

3.結(jié)果判讀：按照使用手冊判讀結(jié)果，即標(biāo)記物質(zhì)控條帶(CC)顯色，表示標(biāo)記物結(jié)合并與底物反應(yīng)有效；擴(kuò)增質(zhì)控條帶(AC)顯色，可排除提取過程、擴(kuò)增和擴(kuò)增抑制劑引起的錯誤；TUB顯色判讀為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，未顯色則為未檢測到MTB。所有野生探針(利福平有8個(gè)野生探針；異煙肼katG基因有1個(gè)野生探針，inhA基因有2個(gè)野生探針)均顯色且所有突變探針均未顯色判讀為敏感；任一野生探針未顯色或任一突變探針顯色判讀為耐藥。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5軟件對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同方法檢測MTB耐藥性結(jié)果的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以比例法檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算GenoType 2.0的檢測效能，即敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、符合率、Kappa值。其中Kappa值<0.40表示一致性差，0.400.75表示一致性好。

結(jié) 果

一、GenoType 2.0和比例法藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果分析

采用GenoType 2.0和比例法藥敏試驗(yàn)分別對349株MTB臨床分離株進(jìn)行利福平和異煙肼的耐藥性檢測，并統(tǒng)計(jì)兩種方法聯(lián)合檢測情況。結(jié)果顯示，GenoType 2.0、比例法藥敏試驗(yàn)和GenoType 2.0+比例法藥敏試驗(yàn)檢測菌株對利福平和異煙肼在敏感、單耐、耐利福平+異煙肼(簡稱“耐兩藥”)檢出率間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，見表1。

二、GenoType 2.0對利福平和異煙肼的耐藥性檢測效能

以比例法藥敏試驗(yàn)為參考標(biāo)準(zhǔn)，GenoType 2.0對利福平和異煙肼耐藥性檢測的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、符合率、Kappa值見表2。其中，2種技術(shù)對利福平和異煙肼耐藥性檢測結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，Kappa值分別為0.91、0.97，均有較好的一致性。對其中GenoType 2.0檢測利福平為敏感而比例法檢測為耐藥的4株菌株經(jīng)GeneXpert MTB/RIF重復(fù)試驗(yàn)后，結(jié)果仍然為對利福平敏感，但未進(jìn)行基因型鑒定。

表1 不同藥敏試驗(yàn)方法檢測349株MTB菌株對利福平和異煙肼的耐藥情況 [株(檢出率，%)]

注在敏感、單耐、耐兩藥菌株間的分布比較上，a為GenoType 2.0與比例法比較，b為GenoType 2.0與GenoType 2.0+比例法的比較，c為比例法與GenoType 2.0+比例法的比較；GenoType 2.0+比例法的耐藥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以其中任一方法耐藥性即判定為“耐藥”，其中單耐利福平菌株在GenoType 2.0檢測中為單耐藥，而在比例法檢測中為耐兩藥，統(tǒng)計(jì)時(shí)納入“耐兩藥”組中

表2 以比例法藥敏試驗(yàn)為參考標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)GenoType 2.0對利福平、異煙肼耐藥性檢測的效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；符合率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/患者總例數(shù)×100%

三、GenoType 2.0檢測利福平和異煙肼耐藥性相關(guān)的突變基因

利福平和異煙肼耐藥性相關(guān)的突變基因發(fā)生頻率的分布見表3。在47株對利福平耐藥的菌株中，25株(53.19%)野生型(WT)8條帶缺失(530～533密碼子)，且rpoBMUT3探針顯色；19株(40.43%)rpoB位點(diǎn)突變發(fā)生在WT 1、2、3、4、7中，其中發(fā)生在WT1有2株、WT2與3有2株、WT3與4有7株、WT7有8株，且相關(guān)突變探針顯色；1株(2.12%)僅出現(xiàn)WT2條帶的缺失，判讀為對利福平耐藥；2株(4.26%)僅出現(xiàn)WT8條帶缺失，且未有相關(guān)突變探針顯色，判讀為對利福平耐藥。在70株異煙肼耐藥菌株中，katG高濃度耐藥突變共51株(72.86%)，其中以S315T1突變?yōu)橹?47株)，占katG突變總數(shù)的92.16%；inhA低濃度耐藥突變共19株(27.14%)，其中以C15T位點(diǎn)突變?yōu)橹?17株)，占總數(shù)的89.47%。GenoType 2.0 技術(shù)檢測的部分條帶見圖1。

討 論

耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)不僅給結(jié)核病的感染控制增加了難度，而且也嚴(yán)重威脅著人們的健康。因此，及時(shí)準(zhǔn)確檢測出MTB的耐藥性，不僅有助于及早發(fā)現(xiàn)MDR-TB患者，有效控制結(jié)核病的傳播，也可為患者的治療用藥提供依據(jù)。傳統(tǒng)的比例法藥敏試驗(yàn)因其能給出最準(zhǔn)確的藥敏試驗(yàn)結(jié)果而成為一直以來的檢測金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其檢測周期過長，需2～3個(gè)月的時(shí)間，明顯延誤患者的診斷及治療。自2008年開始，WHO向全世界推薦德國Hain公司生產(chǎn)的GenoType 1.0代耐多藥結(jié)核分子檢測方法(GenoType?MTBDRplus assay)，并在臨床上廣泛推薦使用，但是，這種方法只能檢測培養(yǎng)陽性或者涂片陽性的標(biāo)本，且敏感度和特異度都不是很高[8]；至2012年，Hain公司對GenoType 1.0代試劑盒進(jìn)行了改進(jìn)，推出了可應(yīng)用于涂片陰性的標(biāo)本、且檢測周期短(24 h即可完成檢測)、敏感度和特異度大幅提高的Hain 2代試劑盒(GenoType 2.0)。

表3 GenoType 2.0檢測MTB對利福平與異煙肼耐藥性相關(guān)突變基因的分布

注“-”指未檢出

從左到右：條帶1，陰性對照(水)；條帶2，陽性對照(MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株，ATCC27294)；條帶3，inhA突變低水平單耐異煙肼；條帶4，非結(jié)核分枝桿菌；條帶5，單耐利福平；條帶6，耐低水平異煙肼的耐多藥肺結(jié)核；條帶7，MTB并對利福平和異煙肼敏感；條帶8，單耐利福平；條帶9，MTB并對利福平和異煙肼敏感；條帶10，katG突變耐高水平異煙肼的耐多藥肺結(jié)核；條帶11，GenoType 2.0檢測自帶比對條圖1 GenoType 2.0 檢測的帶型及基因型的部分條帶展示

從2012年GenoType 2.0問世以來，這種改進(jìn)的方法在國外被陸續(xù)采用，而我國還沒有在臨床上大范圍地推廣。目前為止，只有上海一家醫(yī)院采用了此方法，并分析了其在臨床應(yīng)用中的價(jià)值。該報(bào)道中，對利福平耐藥性檢測的敏感度為100.00%、特異度為97.30%，對異煙肼耐藥性檢測的敏感度為84.44%、特異度為96.94%[9]；而在本實(shí)驗(yàn)中，對利福平耐藥性檢測的敏感度(91.67%)低于上述研究，也低于其他的研究報(bào)道[3,10](認(rèn)為GenoType 2.0對利福平和異煙肼耐藥性檢測的敏感度和特異度均在95%～100%之間)，而對利福平耐藥性檢測的特異度(99.00%)，對異煙肼耐藥性檢測的敏感度(95.89%)和特異度(100.00%)均高于上海的研究，但與文獻(xiàn)[3,11]一致。認(rèn)為本研究對利福平耐藥性檢測的敏感度低，可能與有4株GenoType 2.0技術(shù)檢測為敏感而比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為耐藥的菌株，對利福平耐藥的基因突變發(fā)生在GenoType MTBDRplus檢測的基因之外，導(dǎo)致本檢測方法未能檢測到有關(guān)。而且，這4株菌株經(jīng)GeneXpert MTB/RIF重復(fù)試驗(yàn)后，結(jié)果仍然為對利福平敏感，進(jìn)一步證明4例菌株對利福平的耐藥基因突變發(fā)生在GenoType 2.0 檢測范圍以外。且認(rèn)為不能檢測到的基因突變可能與同一國家不同地區(qū)流行菌株基因型的差異有關(guān)，但本研究未能進(jìn)一步驗(yàn)證菌株基因型。另外，上海的報(bào)道是以痰涂片陽性為納入標(biāo)本，而本研究則以培陽菌株為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，使得本實(shí)驗(yàn)對利福平和異煙肼耐藥性檢測的特異度均很高。最新的一篇報(bào)道指出，在125株MDR-MTB中，有38株(30.4%)菌株的利福平耐藥位點(diǎn)都不在利福平耐藥核心區(qū)域內(nèi)，如果使用目前利福平核心區(qū)域的方法檢測就會遺漏約1/3的利福平耐藥菌株[11]，說明分子生物學(xué)檢測耐藥基因的范圍不僅需要進(jìn)一步擴(kuò)大，而且也說明比例法藥敏試驗(yàn)仍然是檢測MTB耐藥表型的金標(biāo)準(zhǔn)，并不能被分子生物學(xué)方法完全替代。

本研究結(jié)果顯示，對于利福平和異煙肼的耐藥菌株，聯(lián)合檢測(以任一方法耐藥即判定為耐藥)的總耐藥檢出率(13.75%和20.34%)高于GenoType 2.0(13.47%和20.05%)和比例法(12.03%和19.77%)，說明聯(lián)合檢測能提高耐藥性檢測的陽性率，但三組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Kappa值較高，說明兩種方法對于培陽患者耐藥菌株的檢測結(jié)果具有高度一致性，也進(jìn)一步說明了GenoType 2.0 技術(shù)可以獨(dú)立作為臨床診斷的標(biāo)準(zhǔn)[12]；但考慮到GenoType 2.0技術(shù)僅能檢測到最常見的katG/inhA和rpoB基因突變，對其他基因的沉默突變或罕見突變不能準(zhǔn)確判定，故目前臨床診治中仍進(jìn)行聯(lián)合檢測，以避免漏診，有利于耐藥結(jié)核病的防控和患者及時(shí)診治。

本研究結(jié)果顯示，47株利福平耐藥菌株中，有rpoB基因突變且出現(xiàn)突變條帶的利福平耐藥一共44株(93.62%)，提示rpoB基因突變是利福平的高發(fā)耐藥基因，與其他研究結(jié)論是一致的[11，13]。在44株rpoB特異性突變菌株中，有25株發(fā)生在WT8(密碼子S531L)上，且rpoBMUT3探針顯色，占總數(shù)的56.82%，與其他國家的研究報(bào)道一致[10,13]，說明密碼子S531L突變是利福平耐藥最常見的相關(guān)突變；8株發(fā)生在WT7條帶(密碼子H526D)上，占總數(shù)的18.18%；7株發(fā)生在WT3/4條帶(密碼子D516Y)上，占總數(shù)的15.91%；2株出現(xiàn)WT2/3條帶缺失(510～517密碼子缺失)，參照說明書判讀標(biāo)準(zhǔn)，即任何一種野生型探針缺失，菌株則判定為對利福平耐藥，且比例法藥敏試驗(yàn)鑒定為利福平耐藥，與說明書一致，故判定該2株為利福平耐藥；2株出現(xiàn)WT1條帶缺失(505～509密碼子缺失)，占總數(shù)的4.55%，這種突變導(dǎo)致的利福平耐藥非常少見，可能與細(xì)菌基因型差異相關(guān)。rpoB基因突變且未出現(xiàn)突變條帶的利福平耐藥3株，其中1株是WT2條帶缺失(510～513密碼子缺失)、2株是單獨(dú)WT8缺失(530～533密碼子缺失)，若參照說明書判讀標(biāo)準(zhǔn)，菌株應(yīng)判定為對利福平耐藥，但這3株菌株比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為利福平敏感，則以比例法為標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為此3株為利福平敏感株，提示引起WT2、WT8缺失的密碼子可能與基因的沉默突變有關(guān)，即雖然發(fā)生了基因的耐藥突變，但是基因氨基酸的種類和序列并沒有改變，不會影響菌株的耐藥表型，故參考比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果，菌株判定為對利福平敏感。

在70株異煙肼耐藥菌株中，katG高濃度耐藥突變共51株(72.86%)，雖然略低于其他國家報(bào)道的異煙肼耐藥比率[10，14]，但仍是異煙肼耐藥高發(fā)的主要因素，其中47株發(fā)生在密碼子S315T1上，占總數(shù)的92.16%。余下19株(27.14%)的異煙肼低水平耐藥是由于inhA突變引起，其中以C15T突變?yōu)橹?，這一比率高于其他報(bào)道[10-11,14]。考慮與不同國家和地區(qū)的結(jié)核病流行情況、菌株基因型的差異導(dǎo)致MTB基因突變有關(guān)[15]，尤其是異煙肼低水平耐藥和高水平耐藥比率間的差異是比較大的，如不同國家和地區(qū)之間異煙肼耐藥由katG突變引起的報(bào)告比率在31.8%～96.9%之間，由inhA突變引起的在1.5%～45.9%之間[16]。

GenoType 2.0技術(shù)雖然檢測利福平和異煙肼的特異度高、檢測周期短，但作為分子生物學(xué)方法對利福平耐藥性檢測僅限于rpoB基因，異煙肼耐藥性檢測只限于katG基因和inhA基因，而對于其他耐藥基因和耐藥位點(diǎn)的改變引起的耐藥，或者其他耐藥機(jī)制造成的耐藥基因型與耐藥表型不一致的耐藥，本方法不能檢測到，具有一定的局限性。但作為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，GenoType 2.0 在耐藥性檢測的快速、高敏感度和高特異度方面對結(jié)核病患者的早診斷、早治療意義重大，可以在有條件的地區(qū)推廣使用。