邱倩 楊松 陳勇 徐小明 楊再興

目前，化療藥物是治療肺結核的主要方法[1]，但藥物引起的肝腎功能損傷發(fā)生率較高，并且抗結核藥物的不良反應或引起其他并發(fā)癥成為患者漏服或終止治療的主要原因，增加了耐藥結核病的發(fā)生率，是目前抗結核治療亟需解決的問題之一。硫異維甲類化合物A2(sulfur heteroarotinoid A2，SHetA2)是新合成的維生素A類似物。目前，發(fā)現(xiàn)其可選擇性靶向腫瘤細胞發(fā)揮抗癌抑癌活性，而對正常細胞無影響[2]。而SHetA2對MTB感染有無影響未見詳細報道。因此，筆者探討SHetA2在體內(nèi)外對MTB的治療效果，驗證其有無抗結核作用，為臨床應用提供理論依據(jù)。

材料和方法

一、實驗藥品及菌株

SHetA2由美國國家癌癥研究所藥物合成和化學研究室提供。SHetA2使用二氯甲烷溶解，使用前用蒸餾水配成所需濃度溶液備用。異煙肼片(北京市永康藥業(yè)有限公司；批號：H11020585；1 mg/片)研粉，加生理鹽水稀釋，配成所需濃度的混懸液備用。MTB標準菌株H37Rv(ATCC25618)由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病實驗室保藏并提供。

二、實驗動物

無特定病原體(SPF)級昆明小鼠76只，雌雄隨機，6周齡，體質量20～25 g，平均(23.36±1.81) g，均由第三軍醫(yī)大學動物實驗中心提供。所有小鼠均行卡介菌純蛋白衍生物(BCG-PPD)皮膚試驗，觀察72 h，皮試結果為陰性者入選(76只均陰性)。所有實驗均通過重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心動物委員會批準同意。

三、實驗方法

1.建立小鼠肺結核模型：采用霧化吸入感染裝置構建肺結核小鼠動物模型。霧化吸入感染裝置為美國Glas-Col公司制造，型號為099CA-4212。根據(jù)文獻[3-4]所描述的方法，采用MTB標準菌株H37Rv [106菌落形成單位(CFU)]對76只小鼠進行吸入感染實驗。感染后將小鼠轉移至感染實驗室內(nèi)飼養(yǎng)，7周后采集小鼠靜脈血2 ml，測定機體內(nèi)的MTB。對于機體內(nèi)含有MTB，且影像學檢查肺部存在明顯的病灶部位視為建模成功。共有62只小鼠建模成功，為樣本量統(tǒng)一，納入60只。采用數(shù)字表法隨機將實驗成功建模的肺結核小鼠分為對照組、異煙肼組、SHetA2組，每組20 只。

2.MTB培養(yǎng)：將MTB標準菌株H37Rv在7H9培養(yǎng)液內(nèi)37 ℃培養(yǎng)4周后收集細菌。

3.最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)測定：采用試管法，將藥物SHetA2(2.5 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml、20.0 μg/ml)分別加入蘇通培養(yǎng)基內(nèi)后，加入等量的菌液(1 mg/ml，每支接種0.1 ml，含106CFU細菌)，于37 ℃培養(yǎng)2周后, 每支吸0.1 ml轉種于2支改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基斜面，同時設空白對照管。在含藥蘇通培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)2周抑制細菌生長的最小濃度即為MIC。

4.藥物治療：(1)異煙肼組：給予同體積的異煙肼灌胃。參照文獻[5]，對肺結核給予常規(guī)異煙肼(5 mg·kg-1·d-1)治療，以正常成人體質量70 kg，小鼠體質量20 g，按體表面積比(0.0026)等效劑量進行換算給藥，小鼠給藥量為45 mg·kg-1·d-1；每日灌胃1次；(2)SHetA2組：給予同體積的SHetA2混懸液(20 mg·kg-1·d-1)灌胃，每日灌胃2次；(3)對照組：給予同體積的生理鹽水灌胃，每日灌胃1次。以上3組均于建模成功后給藥，連續(xù)灌胃45 d。

5.檢測指標：(1)體征及體質量變化：觀察3組小鼠治療45 d后體征(精神狀態(tài)、毛色、飲食、尿便、活動)的變化和體質量變化情況。(2)肺組織細菌載荷量計數(shù)和HE染色：在最后一次給藥后24 h處死小鼠，立刻解剖，取小鼠肺臟，肉眼觀察肺組織有無結節(jié)、水腫、萎縮等病變，病變的嚴重程度及范圍。然后將小鼠左肺組織剪碎，置于無菌組織勻漿器中，加入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)研磨勻漿，視為原液，連續(xù)6次10倍稀釋，取0.1 ml勻漿稀釋液接種于直徑6 cm改良羅氏培養(yǎng)平板，每個稀釋度做2個復板，37 ℃培養(yǎng)，4周后觀察MTB的生長情況，計算菌落數(shù)，結果經(jīng)對數(shù)轉換(lg10)后表示。同時將各剩余組織置于10%福爾馬林中固定并做切片進行HE染色，光鏡下觀察，分為4級：無、輕、中、重度(表1)。

表1 肺臟病變(HE染色)分級標準

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、SHetA2體外對MTB生長的影響

將不同濃度的藥物SHetA2 (2.5 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml、20.0 μg/ml)分別加入含MTB的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)一定時間后，發(fā)現(xiàn)SHetA2可抑制MTB的生長，具有濃度依賴性，其MIC為10 μg/ml。

二、SHetA2體內(nèi)對結核感染小鼠的作用

1.體征及體質量變化：SHetA2組和異煙肼組小鼠治療后精神狀態(tài)佳、飲食及尿便正常，未出現(xiàn)死亡。對照組小鼠偶有咯血，毛色欠光澤，精神萎靡，活動減少。三組小鼠治療前體質量比較差異無統(tǒng)計學意義；治療45 d后，SHetA2組和異煙肼組小鼠體質量高于對照組，SHetA2組和異煙肼組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(q=0.10，P=0.998)，見表2。

表2 各組小鼠治療前后體質量變化情況

注a：與對照組治療45 d后比較，q=3.44，P=0.047；b：與對照組治療45 d后比較，q=3.53，P=0.040

2.小鼠肺臟觀察：對照組小鼠肺臟增大，膨脹充血，表面均密布粟粒樣結節(jié)或散在5～10個大小不等結節(jié)，直徑0.1～0.5 cm，觸之較硬，切開存在砂礫感。異煙肼組和SHetA2組小鼠肺臟略有增大，呈鮮紅色或暗紅色，肺臟多散在3～6個白色或灰白色結節(jié)，直徑0.1～0.3 cm，或偶見密布粟粒樣結節(jié)。

HE染色后觀察，對照組肺組織病變以滲出為主，組織結構破壞，白細胞聚集，有大量炎性細胞浸潤及肺實變，肺臟可見典型結核結節(jié)，炎癥反應嚴重；異煙肼組和SHetA2組均以少量滲出或少量增生性病變?yōu)橹?，組織結構部分破壞，見少量炎癥細胞浸潤。對照組小鼠肺臟炎癥重度的構成比明顯高于異煙肼組和SHetA2組(χ2=32.18，P<0.01)，見表3。

表3 各組小鼠肺臟病理組織學檢查病變分級情況

3.小鼠肺臟感染細菌數(shù)量：菌落計數(shù)結果(lg10 CFU/ml)顯示，對照組、異煙肼組、SHetA2組小鼠肺臟感染細菌數(shù)量分別為7.01±1.23、2.59±0.87、2.25±0.94，對照組明顯高于異煙肼組和SHetA2組，差異有統(tǒng)計學意義(F=6.71，P=0.002)；而異煙肼組與SHetA2組比較，差異無統(tǒng)計學意義(q=0.33，P=0.970)。

討 論

MTB是結核病的致病菌，主要通過呼吸道傳播，可侵襲很多器官，其中以肺部感染最為常見。目前，肺結核疫情形勢嚴峻，傳統(tǒng)的抗結核藥物治療周期長，不良反應大；因此，國內(nèi)外加快了對新型抗結核藥物的研發(fā)，取得了一些成果，出現(xiàn)了一些新型的、不同于傳統(tǒng)抗結核藥物作用機制的藥物，如貝達喹啉、德拉馬尼、SQ109、PA-824、TBA-354、BTZ043等[6]，但這些新藥仍有嚴重不良反應，限制了其臨床應用[7]。

異維甲類化合物(Hets)是一類新的有抗癌活性的小分子藥物，最初源自于維生素A類似物的維甲類化合物，但它在維甲類化合物的環(huán)中插入了一個雜原子，稱之為異維甲類化合物。維甲類化合物的毒性是天然維生素A的1000倍以上，而雜原子可使維甲類化合物的毒性降回原來的1/1000以下，達到和天然維生素A相似的水平[8]。通過構效關系研究發(fā)現(xiàn)，Hets有體內(nèi)抗腫瘤活性[9]。Hets可通過兩個原子(富有彈性的尿素氮或硫脲)連接元件替換，生成撓性異維甲類化合物(flexible heteroarotinoid，F(xiàn)lex-Hets)。和維甲類化合物及普通的Hets一樣，F(xiàn)lex-Hets可抑制細胞生長和誘導分化。不同的是，F(xiàn)lex-Hets還可以不依賴核視黃酸受體的機制誘導細胞凋亡[10]。因此，F(xiàn)lex-Hets不引起其他維甲類化合物的不良反應，如皮膚刺激性和致畸性[11]。

Flex-Het包含了一個硫雜原子、一個硫脲鏈接元件和一個NO2成分。作為Flex-Het里一個新合成的化合物，SHetA2有在所有的癌細胞系中最強和最有潛力的生長抑制活性，同時基本不影響正常細胞的分化。因此，SHetA2被用于癌癥治療和預防領域。研究發(fā)現(xiàn)，SHetA2可在體內(nèi)外抑制腎癌、卵巢癌、肺癌等發(fā)生和發(fā)展[12-13]。但至今未見確切報道其在肺結核方面的應用。目前，僅Ibrahim等[14]在2016年發(fā)現(xiàn)SHetA2在體外表現(xiàn)為對MTB的生長有抑制作用，但至今未見具體直接的數(shù)據(jù)報道。

筆者采用霧化吸入感染法建立肺結核小鼠模型，通過靜脈血測定和影像學檢查評價造模，結果表明，本次實驗肺結核小鼠模型造模成功。對肺結核小鼠模型施以不同的處理(生理鹽水、異煙肼、SHetA2)后，與對照組比較，異煙肼、SHetA2治療肺結核小鼠后，其一般體征及客觀指標等方面皆有不同程度的改善：(1)一般體征：體質量增長正常，皮毛光滑潤澤，進食正常，精神狀況良好，活動度佳。(2)肺臟組織形態(tài)：肉眼觀察肺組織結核結節(jié)較少；光鏡下治療組肺臟炎癥反應較對照組明顯減輕，而SHetA2組與異煙肼組比較，無明顯差別。并且，相對于異煙肼常見的胃腸道反應、周圍神經(jīng)炎、肝損傷、過敏反應、血液系統(tǒng)癥狀、內(nèi)分泌失調(diào)等不良反應，SHetA2的不良反應極小，并且對正常細胞無害[15]，表明SHetA2或可成為最有潛力的抗結核化學藥物的候選。

Zhang等[16]通過高效液相色譜法/紫外線(high performance liquid chromatography/ultraviolet，HPLC/UV)方法研究了SHetA2在小鼠體內(nèi)的藥代動力學，發(fā)現(xiàn)標準曲線在25 nmol/L和2500 nmol/L 之間呈線性關系，SHetA2被發(fā)現(xiàn)在4 ℃ 條件下在小鼠血漿中是穩(wěn)定的，24 h后無明顯丟失。然而，在37 ℃條件下，SHetA2的濃度呈單指數(shù)下降，其半衰期為12.7 h；而以20 mg/kg或60 mg/kg 的劑量口服，SHetA2口服的生物利用度分別為15%和19%。因此，筆者選用20 mg/kg作為口服的劑量，以每日灌胃2次的治療頻次進行研究。眾所周知，MTB在肺泡巨噬細胞內(nèi)存活和復制。研究發(fā)現(xiàn)，SHetA2有巨噬細胞靶向作用[14]。因此，筆者認為SHetA2通過靶向巨噬細胞發(fā)揮抗結核的作用，但具體機制不明，下一步我們將深入研究。

綜上，SHetA2治療肺結核小鼠模型，能明顯改善小鼠的一般體征及組織病變，減輕肺臟炎癥反應，在體內(nèi)外抑制MTB的生長。其抗結核的作用和異煙肼一致，因其極小的不良反應，SHetA2或可成為有潛力的抗結核化學藥物的候選。