秦利軍，趙德剛

1.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴陽(yáng)市花溪區(qū)花溪二道 550025

2.貴州大學(xué)山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)市花溪區(qū)霞暉路1 號(hào) 550025

3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴陽(yáng)市花溪區(qū)金欣社區(qū)1 號(hào) 550006

自1983 年Zambryski 等［1］和Benfey 等［2］將根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti 質(zhì)粒載體上的外源基因?qū)霟煵菁?xì)胞獲得第1 株轉(zhuǎn)基因植物以來，基因工程技術(shù)開創(chuàng)了植物遺傳改良的新紀(jì)元。利用該技術(shù)先后創(chuàng)制了γ-亞油酸（γ-linolenic acid，GLA）含量顯著增加的轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana tabacum）［3］、番茄（Solanum lycopersicum）［4］和油菜（Brassica napus）［5］、耐鹽耐冷等非生物脅迫能力較高的轉(zhuǎn)基因作物［6-8］，抗Cercospora nicotianae 病害［9］以及低去甲基煙堿累積的轉(zhuǎn)基因煙草［10］。煙草病害是影響煙草生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)的重要因素，而煙草病害中以煙草花葉病毒（TMV）病在世界各煙區(qū)的流行性及破壞性最強(qiáng)［11］。因此，挖掘TMV 的抗性煙草種質(zhì)，利用抗性基因?qū)煵葸M(jìn)行遺傳改良是快速、經(jīng)濟(jì)的新型育種手段之一［12］。早期分離鑒定的TMV 抗性基因包括黏煙草（Nicotiana glutinosa）的N 基 因［13］、普 通煙草（N.tabacum）Xanthi品種的NH基因［14］及N.tabacum Samsun品種的NL-C26基因［15］，其中N基因和NH基因已被廣泛應(yīng)用于煙草的抗性育種研究中［16-17］。近年來，李梅云等［16］對(duì)不同類型煙草種質(zhì)進(jìn)行的TMV 抗性比較發(fā)現(xiàn)，黃花煙（Nicotiana rustica）及其雜交材料對(duì)TMV的免疫性最強(qiáng)。目前已報(bào)道的黃花煙（N.rustica）來源的TMV抗性基因?yàn)镃N基因，分離自HZNH品種。該基因與早期研究的N基因擁有93.63%序列同源一致性的NrCN基因［17］，之后將NrCN 基因?qū)雽?duì)TMV敏感的煙草中，發(fā)現(xiàn)NrCN 基因能顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV 的抗性［18］。雖然利用這些優(yōu)異抗病基因?yàn)閯?chuàng)制和培育抗病毒煙草新種質(zhì)提供了重要的育種策略，但獲得的轉(zhuǎn)基因生物通常存在諸多安全性的問題［19-20］。Qin 等［21］在前期研究的基礎(chǔ)上，引入了含有“Gene-deletor”的植物表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了外源基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的定向清除?？梢?，在提高煙草抗病性的同時(shí)，創(chuàng)制品質(zhì)優(yōu)質(zhì)的煙草新種質(zhì)尤為重要。為此，以前期試驗(yàn)篩選獲得的T2代獨(dú)立轉(zhuǎn)基因煙草植株為材料，通過分析不同轉(zhuǎn)基因煙草株系對(duì)TMV的抗性，明確NrCN 導(dǎo)入對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草光合特征和煙葉化學(xué)成分的影響，旨在篩選和培育優(yōu)質(zhì)抗病的煙草新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：普通煙草K326（N.tabacum L.cv.K326）及3 個(gè)T1代獨(dú)立轉(zhuǎn)基因煙草株系Q1、Q2 和Q3 的種子［21］撒播于煙草育苗盤中進(jìn)行漂浮育苗。轉(zhuǎn)基因煙草植株含有擬南芥（A.thaliana）葉片衰老特異表達(dá)基因AtSAG12 啟動(dòng)子PSAG12，可驅(qū)動(dòng)重組酶基因FLP 表達(dá)，并清除外源基因。普通煙草（N.tabacum）泛素蛋白基因Ubi 啟動(dòng)子PUbi啟動(dòng)外源篩選報(bào)告融合基因Gus::Bar 表達(dá)，以及普通煙草（N.tabacum）聚泛素蛋白基因Ubi.U4（GenBank：X77456.1）啟 動(dòng) 子PUbi.U4驅(qū) 動(dòng) 黃 花 煙（N.rustica）TMV 抗性基因NrCN 表達(dá)的3 組表達(dá)元件，植物表達(dá)載體圖譜見圖1。前期的研究結(jié)果Q1 和Q3 株系均含1 個(gè)外源基因拷貝（以擴(kuò)增的部分Ubi.U4-NrCN 片段作為探針雜交得到），而Q2 株系含2個(gè)外源基因拷貝［21］。1.1.2 試劑與儀器

植物DNA Kit 購(gòu)自天根（北京）生物科技有限公司；RNA Kit 購(gòu)自美國(guó)OMEGA Bio-Tek 有限公司；DL 2000 DNA Marker 購(gòu)自日本Takara（大連）生物公司；MultiScribeTMReverse Transcriptase Kit、Power SYBR?Green PCR Master Mix 購(gòu) 自 美 國(guó)Applied Biosystems 公司；可溶性糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)及抗病相關(guān)基因表達(dá)分析引物均由上海旭冠生物科技有限公司合成；聚乙氧基月桂醚（brij-35）（北京拜爾迪生物公司）、十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）（分析純，西隴化工股份有限公司）、檸檬酸（C6H8O7·H2O）（重分析純，慶川東化工集團(tuán)有限公司）、對(duì)氨基苯磺酸（C6H7NO3S）（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、二氯異氰尿酸鈉（C3O3N3Cl2Na）［阿法埃莎（天津）化學(xué)有限公司］、煙堿（C10H14N2，英國(guó)BDH 實(shí)驗(yàn)室）、烤煙標(biāo)準(zhǔn)樣（中國(guó)煙草總公司青州煙草研究所）、對(duì)羥基苯甲酸酰肼（C7H6O3）（分析純，西隴化工股份有限公司）。

圖1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建圖譜Fig.1 A schematic diagram of plant expression vector

C1000 TouchTMThermal Cycler PCR 儀 、PowerPac BasicTM凝膠電泳儀和凝膠成像儀ChemiDocTMXRS+（美國(guó)BIO-RAD 公司）；7500 熒光定 量PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）；LI-6400 光合測(cè)定儀（中國(guó)北京力高泰科技有限公司）；Alliance-Futura 連續(xù)流動(dòng)分析儀（深圳市一正科技有限公司）；SKD-20S2 紅外石英消化爐（上海沛歐分析儀器有限公司）；Sherwood 420 火焰光度計(jì)（上海書俊儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

以3～5 葉期的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草幼苗心葉為材料，進(jìn)行GUS 組織化學(xué)染色。剪取煙苗心葉后浸沒于GUS 染色液并置于真空儀中，以25 kPa 抽真空15 min 后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜。次日依次用95%、75%、50%和20%乙醇梯度分別浸提葉片色素，以觀察GUS 染色結(jié)果。GUS 染 色 液 配 制：100 mmol·L-1Tris-HCl，0.5 mmol·L-1NaCl，0.02 mmol·L-1K3Fe（CN）6，50 mmol·L-1CH3OH，8.65 μmmol·L-1X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸）。按照植物DNA Kit 試劑盒操作說明書提取心葉GUS 染色陽(yáng)性煙苗的總基因組DNA。以基因組DNA 為模板，利用引 物FUbi.U4（5’-AGGAGCCTCTTTGTTCCC-3’）和RUbi.CN（5’-TCATTCAAACACCACCTCG-3’）對(duì)特異性片段（Ubi.U4-NrCN）［807 bp，該片段含550 bp 普通煙Ubi.U4 啟動(dòng)子（PUbi.U4）序列和257 bp 黃花煙NrCN 序列］進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃3 min；94 ℃20 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個(gè)循環(huán)；最終72 ℃保存5 min。

待漂浮盤上煙苗長(zhǎng)至3～5 葉期時(shí)，每株系（轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因）各取15 株長(zhǎng)勢(shì)一致且生長(zhǎng)良好的煙苗，分別移栽至含種植基質(zhì)（菜園土∶Hawita 泥炭土=3∶1）的花盆（高16 cm，直徑20 cm，種植基質(zhì)10 kg）中。每盆施1～2 g 復(fù)合肥（N∶P2O5∶K2O=10∶10∶12）作為底肥，盆栽期間追肥1 次。煙草植株在相對(duì)濕度為70%～80%，16 h 光照/8 h 黑暗，25～28 ℃條件下培養(yǎng)。煙苗移栽后45 d 時(shí)，參照標(biāo)準(zhǔn)方法［22］進(jìn)行煙草農(nóng)藝性狀指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 TMV 接種及NrCN 基因表達(dá)分析

參照Kasschau 等［23］的半葉枯斑法以6～8 葉期T2代轉(zhuǎn)基因植株（Q1、Q2 和Q3）與非轉(zhuǎn)基因煙苗自下向上數(shù)第3 片完展葉進(jìn)行摩擦接種，每個(gè)株系各接種3 株煙。接種后的煙株置于人工培養(yǎng)箱中，在光照1 600～1 800 Lx，溫度25～27 ℃，相對(duì)濕度＞80%的培養(yǎng)條件培養(yǎng)5 d。之后取煙株（每株系均取3 株）接種部位的臨近葉片0.1 g，參照植物RNA Kit 及Reverse Transcriptase Kit 操作說明書提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以煙草肌動(dòng)蛋白基因β-Actin 為內(nèi)參基因，用Real-time PCR 分析cDNA 模板中NrCN 基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)株系設(shè)置3 次重復(fù)。NrCN 及β-Actin 特異性擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 Real-Time PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of real-time PCR

1.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草煙葉化學(xué)成分的測(cè)定

1.2.3.1 煙葉取樣及預(yù)處理

取移栽后50～60 d 的煙株自下向上數(shù)13～15 葉位（3 片）煙葉混合后，參照標(biāo)準(zhǔn)方法［24］對(duì)煙樣進(jìn)行烘干預(yù)處理?；旌蠠熑~置于臺(tái)式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱［HWXT-9245A，深圳AODEMA（澳德瑪）公司］中于110 ℃殺青10 min，再將溫度調(diào)至80 ℃左右烘至恒質(zhì)量，用于煙葉化學(xué)成分分析。分別取打頂后10 d 和非打頂煙株的相同葉位葉片，按照標(biāo)準(zhǔn)方法［24］（略有改動(dòng)）進(jìn)行樣品處理與分析，煙葉烘干后放入粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎、研磨，過0.425 mm（40 目）網(wǎng)篩，密封保存?zhèn)溆?。每個(gè)株系（轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因）均選取3 株煙。

1.2.3.2 煙葉化學(xué)成分的測(cè)定

用Denver Instument 電子天平（0.1 mg，北京丹佛儀器有限公司），精確稱取干燥煙粉樣品0.25 g至50 mL 的具塞錐形瓶中，參照標(biāo)準(zhǔn)方法［25］測(cè)定煙葉總植物堿含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；稱取0.10 g 煙粉樣品于消化管中，按照標(biāo)準(zhǔn)方法［26］測(cè)定煙葉總氮含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；稱取煙粉樣品0.25 g 至50 mL 的具塞錐形瓶中，加入25 mL水后于室溫下振蕩萃取30 min，參照標(biāo)準(zhǔn)方法［27］測(cè)定煙葉鉀離子含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；稱取煙粉樣品0.25 g 至50 mL 的具塞錐形瓶中，加入25 mL 水后于室溫下振蕩萃取30 min，按照標(biāo)準(zhǔn)方法［28］測(cè)定煙葉氯離子含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。每株煙樣重復(fù)測(cè)定3次，取3次重復(fù)的平均值。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草煙葉可溶性糖及光合特征指標(biāo)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取煙樣粉末0.1 g，分別加入1 mL 蒸餾水混勻成勻漿，然后倒入有蓋的離心管中，95 ℃水浴處理10 min（蓋緊，以防止水分散失）。冷卻后，以8 000 g、25 ℃離心10 min，取其上清液至10 mL 的試管中，再用蒸餾水定容到10 mL，搖勻后備用。按照可溶性糖測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算煙樣中可溶性糖含量，每株煙樣重復(fù)測(cè)定3 次，取3 次重復(fù)的平均值。

利用LI-6400 光合測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定團(tuán)棵期（移栽后45 d）煙草自下向上數(shù)第6 片完展葉的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）和水分利用率（WUE）等指標(biāo)。測(cè)定條件：紅藍(lán)光源，葉室溫度設(shè)定為28 ℃，氣體流量500 μmol·s-1，CO2濃度變化范圍為377～400 μmol·mol-1。光合有效輻射（PAR）分別設(shè)置為1 000、1 300 和1 500 μmol·m-2·s-1，再按照設(shè)定要求從PAR 值由高至低的順序進(jìn)行測(cè)定，繪制PAR光合響應(yīng)曲線，每株煙樣重復(fù)測(cè)定3 次，取3 次重復(fù)的平均值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003 及SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。采用統(tǒng)計(jì)方法中獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)，測(cè)定各組間差異的顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定

對(duì)3～5 葉期T2代轉(zhuǎn)基因煙草植株GUS 染色和PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，共篩選獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株38 株，其中Q1 株系13 株、Q2 株系10 株和Q3 株系15 株，見圖2。另外，對(duì)團(tuán)棵期的3 個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀指標(biāo)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，株高、葉片數(shù)等農(nóng)藝指標(biāo)均無(wú)明顯差異。

Q1、Q2、Q3.不同的轉(zhuǎn)基因株系；TP、WT.分別為轉(zhuǎn)基因和野生型植株；M.DL 2000 DNA marker；P.陽(yáng)性對(duì)照；N.陰性對(duì)照；A.不同煙草植株生長(zhǎng)表型；B.煙草植株的GUS 染色圖；C.轉(zhuǎn)基因煙草的PCR 鑒定圖

2.2 TMV 接種對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草NrCN 表達(dá)的影響

TMV 接種轉(zhuǎn)基因3 個(gè)煙草株系（Q1、Q2 和Q3）后，煙草植株接種葉片均形成抗病壞死斑，而非轉(zhuǎn)基因植株未見壞死斑形成。推測(cè)NrCN 的導(dǎo)入誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因煙草產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而通過壞死斑的形成而抑制TMV 的擴(kuò)散。這與前人對(duì)野生型黏煙草（N.glutinosa）中TMV 抗性N 基因介導(dǎo)的抗病作用機(jī)制的研究結(jié)果相似，即TMV 的侵入引起了N 基因表達(dá)量的顯著上調(diào)［13］。通過接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種第5 天時(shí)Q2 植株出現(xiàn)的壞死斑最多，Q1 植株次之（圖3A）。進(jìn)一步對(duì)NrCN 基因的qRT-PCR 分析表明，接種前非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因煙草均有NrCN 的表達(dá)，但該基因在兩種植株中表達(dá)量均較低，隨著接種后時(shí)間的推進(jìn)，Q1、Q2 和Q3 植株中NrCN 基因表達(dá)量有不同程度增加，其中以Q2 株系中NrCN 表達(dá)量最高（擴(kuò)增條帶最亮）。非轉(zhuǎn)基因煙草接種前后均檢測(cè)到NrCN 基因的表達(dá)，推測(cè)非轉(zhuǎn)基因煙草中可能存在與NrCN基因同源且無(wú)抗病功能的基因（圖3B 和3C）。推測(cè)Q2 株系形成較多數(shù)量的壞死斑可能與NrCN 在Q2 株系中的多拷貝有關(guān)，而基因拷貝數(shù)與其表達(dá)量間存在一定的聯(lián)系。Li 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，短日生長(zhǎng)豌豆（Pisum sativum）花后特異基因PPF1在轉(zhuǎn)基因水稻中存在多拷貝，可引起PPF1基因表達(dá)受到抑制，拷貝數(shù)與基因表達(dá)量表現(xiàn)出負(fù)向相關(guān)。而本研究中多拷貝的NrCN 出現(xiàn)了高表達(dá)量，兩者又表現(xiàn)為正向相關(guān)，這可能是由于外源基因在宿主染色體插入位點(diǎn)不同或是由于這些基因的啟動(dòng)子受特異因子調(diào)控啟動(dòng)引起的表達(dá)差異造成的。

圖3 煙草植株接種TMV 表型比較及NrCN 基因表達(dá)量分析Fig.3 Phenotype and NrCN expression levels of transgenic tobacco inoculated TMV

2.3 NrCN 基因?qū)D(zhuǎn)基因煙草化學(xué)成分的影響

由圖4 可以看出，除Q1 株系外，打頂前轉(zhuǎn)基因Q2 和Q3 株系的總植物堿（以煙堿計(jì)）和總氮含量均顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株。打頂引起了所有煙草植株的總植物堿積累量增加，其中以Q1株系增幅最大，為59.5%，Q3 株系次之，為28.7%，Q2 株系最低，為18.2%（圖4A）。盡管打頂增加了煙株總植物堿的積累量，但Q2 和Q3 株系打頂后其總植物堿含量仍顯著低于非轉(zhuǎn)基因煙草。打頂前，轉(zhuǎn)基因株系Q2 和Q3 的總氮含量也顯著低于非轉(zhuǎn)基因植株和Q1 株系，打頂后各植株的總氮含量均有不同程度下降，Q1 株系總氮含量高于非轉(zhuǎn)基因植株12.6%，Q2 株系總氮含量低于非轉(zhuǎn)基因植株7.6%（圖4B），說明不同轉(zhuǎn)基因植株在應(yīng)答打頂處理時(shí)調(diào)節(jié)總氮含量的能力存在一定差異。其中Q2 株系推測(cè)可能是由于多拷貝基因的插入破壞了植物堿合成的相關(guān)基因，最終導(dǎo)致了總植物堿含量顯著下降。打頂未顯著增加總植物堿的積累量，這暗示著Q2 株系中總植物堿合成受到了一定抑制。同樣，打頂也引起各煙草株系中鉀離子含量下降，打頂后除Q1 株系鉀離子含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株外，其余2 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中鉀離子含量與非轉(zhuǎn)基因植株無(wú)顯著差異（圖4C）；在煙株打頂前后，轉(zhuǎn)基因Q2 株系的氯離子含量均顯著高于Q1、Q3和非轉(zhuǎn)基因植株，且打頂引起的氯離子含量降幅最小，僅為非轉(zhuǎn)基因植株的7.58%（圖4D），說明NrCN 基因的多拷貝還導(dǎo)致了Q2 株系中Cl-含量提高，而過高的氯離子含量又會(huì)影響煙葉的品質(zhì)［30］。不同煙草株系可溶性糖含量的測(cè)定結(jié)果（圖5）表明，除Q3 株系外，Q1 和Q2 株系可溶性糖含量分別表現(xiàn)為顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）高于非轉(zhuǎn)基因植株（14.82 mg·g-1），分別為21.88 和16.85 mg·g-1。

圖4 NrCN 基因?qū)煵轃熑~化學(xué)成分的影響Fig.4 Effects of NrCN on tobacco leaf chemical compositions

圖5 打頂前不同煙草株系可溶性糖含量的比較Fig.5 Soluble sugar contents in different tobacco plants before topping

2.4 轉(zhuǎn)基因植株光合作用指標(biāo)

圖6 打頂前不同煙草株系光合特征指標(biāo)的比較Fig.6 Photosynthetic indexes in different tobacco plants before topping

各煙草株系在一定光強(qiáng)范圍（1 000～1 500 μmol·m-2·s-1）內(nèi)的光合特征指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（圖6）表明，Q2 株系的Pn 值顯著低于Q1、Q3 和非轉(zhuǎn)基因株系。低光強(qiáng)時(shí)（1 000 μmol·m-2·s-1）Q1 株系和非轉(zhuǎn)基因植株P(guān)n 值相當(dāng)，均顯著高于Q3 株系；當(dāng)光強(qiáng)增加至1 300 μmol·m-2·s-1時(shí)，Q1、Q3和非轉(zhuǎn)基因植株的Pn 值差異不顯著；但當(dāng)光強(qiáng)增加到1 500 μmol·m-2·s-1時(shí)，非轉(zhuǎn)基因植株的Pn值顯著高于轉(zhuǎn)基因植株（圖6A）。在光強(qiáng)1 000～1 500 μmol·m-2·s-1范圍內(nèi)，Q2 株系的氣孔導(dǎo)度值顯著低于其他3 個(gè)株系，且非轉(zhuǎn)基因株系的Gs 值在光強(qiáng)為1 000、1 300 和1 500 μmol·m-2·s-1時(shí)均顯著高于Q1 株系；除在光強(qiáng)1 300 μmol·m-2·s-1時(shí)Q3 株系Gs 值顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株外，低光強(qiáng)（1 000 μmol·m-2·s-1）和高光強(qiáng)（1 500 μmol·m-2·s-1）均低于非轉(zhuǎn)基因植株，差異達(dá)到顯著水平（圖6B）。同樣，光照強(qiáng)度在1 000～1 500 μmol·m-2·s-1范圍時(shí)，Q2 株系的蒸騰速率值也顯著低于其他3個(gè)株系。在低光照強(qiáng)度（1 000 μmol·m-2·s-1）時(shí)，Q1 株系的蒸騰速率最高，為2.5 μmolH2O·m-2·s-1；非轉(zhuǎn)基因株系次之，為2.5 μmolH2O·m-2·s-1；Q2 株系最低，為0.7 μmolH2O·m-2·s-1。隨著光照強(qiáng)度的增加，除Q1 株系的Tr 值下降外，Q2、Q3 和非轉(zhuǎn)基因株系的Tr 值均增加，后兩者的蒸騰速率值始終高于前者，差異達(dá)到顯著水平（圖6C）。因此，在設(shè)定光強(qiáng)范圍（1 000～1 500 μmol·m2·s-1）內(nèi)Q2株系中的多拷貝NrCN 基因?qū)е轮仓關(guān)n、Gs 和Tr的顯著下降，推測(cè)導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是由于過量NrCN 基因表達(dá)引起CN 蛋白的顯著積累。而后者作為免疫應(yīng)答的重要組分，若含量過高時(shí)可能會(huì)引起轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)期處于一種免疫應(yīng)答的應(yīng)激狀態(tài)，轉(zhuǎn)基因植株勢(shì)必會(huì)通過下調(diào)光合作用以消除由免疫應(yīng)激引起的高強(qiáng)代謝水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)植株的生理平衡。在本試驗(yàn)光照強(qiáng)度范圍內(nèi)，WUE 指標(biāo)在Q2 株系中顯著高于轉(zhuǎn)基因Q1、Q3 和非轉(zhuǎn)基因株系。當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)1 500 μmol·m2·s-1時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株的WUE 均顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株，說明光照強(qiáng)度高時(shí)，NrCN 基因的導(dǎo)入又可通過提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)水分的利用來平衡植物體的光合效率。也說明不同轉(zhuǎn)基因株系在應(yīng)答不同光照強(qiáng)度誘發(fā)的光合作用時(shí)，由于外源基因拷貝數(shù)及插入染色體位置不同，使不同轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出光合特征指標(biāo)變化方面的差異。此外，有研究表明，植株中K+含量與光合作用也存在一定的關(guān)系，轉(zhuǎn)基因煙株鉀含量積累能力的差異可能也會(huì)引起各轉(zhuǎn)基因植株光合特征指標(biāo)的改變［31-32］。

可見，Q2 株系比Q1 和Q3 株系的抗病性強(qiáng)且綜合品質(zhì)較好，但鑒于前期研究結(jié)果表明該株系為多拷貝轉(zhuǎn)基因植株，不利于作為親本材料進(jìn)行育種試驗(yàn)。因此，結(jié)合抗病性和煙葉品質(zhì)分析結(jié)果，確定Q1 株系作為親本材料更有利于培育抗TMV 且煙葉品質(zhì)優(yōu)良的種質(zhì)或品種。

3 結(jié)論

以含TMV 抗性NrCN 基因的煙草為材料，在人工培養(yǎng)箱和溫室條件下的試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草均能較好地應(yīng)答TMV 感染，且對(duì)不同株系品質(zhì)的影響存在一定差異。其中轉(zhuǎn)基因Q1 株系（含單拷貝抗病NrCN 基因）與非轉(zhuǎn)基因野生型栽

培煙草相比，煙草抗病性顯著提高，煙葉總植物堿、總氮及鉀離子含量等化學(xué)成分指標(biāo)均達(dá)到或高于非轉(zhuǎn)基因野生型栽培煙草。另外，Q1 株系在低光強(qiáng)（1 000 μmol·m2·s-1）時(shí)其Pn、Gs 和Tr 值均顯著提高，但隨著光強(qiáng)的增強(qiáng)這3 個(gè)光合作用指標(biāo)值又逐漸降低，說明低光照強(qiáng)度即可滿足Q1株系的光合作用。因此，Q1 轉(zhuǎn)基因煙草株系可作為培育抗病優(yōu)質(zhì)煙草新種質(zhì)或新品種的理想親本材料。