章安源,章安雯,牛華星,陳 玲*,張 琦

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250022； 2.棗莊職業(yè)學(xué)院，山東棗莊 277100)

喹乙醇、乙酰甲喹屬于喹噁啉類合成抗菌藥，具有廣譜抗菌活性，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。因此被廣泛地用作抗菌促生長(zhǎng)劑和提高飼料轉(zhuǎn)化率制劑[1-3]；為保障動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全，維護(hù)公共衛(wèi)生安全和生態(tài)安全，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織決定自2019年5月1日起，停止經(jīng)營(yíng)、使用喹乙醇等3種獸藥的原料藥及各種制劑[4]。

但鑒于少數(shù)不法獸藥企業(yè)在利益的驅(qū)動(dòng)下，在清熱解毒類和促生長(zhǎng)類獸用中獸藥散劑中違規(guī)添加。采用液相色譜法檢測(cè)喹乙醇，樣品前處理過(guò)程繁瑣,檢出限也較高,缺乏針對(duì)性的檢測(cè)方法，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失；另一方面也會(huì)給人造成食源性細(xì)菌耐藥性等的潛在危害[5]。

研究參考了飼料殘留的檢測(cè)方法[6-7]，首次建立了扶正解毒散劑中非法添加物喹乙醇、乙酰甲喹的超高效相串聯(lián)質(zhì)譜法，此方法可以作為非法添加喹乙醇、乙酰甲喹的定性、定量測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器 AE-240電子天平(瑞士Mettlrer Toledo 公司)；LC-30AD高效液相色譜儀(島津)，SCIEx四極桿帶電離噴霧源串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB公司)； KQ - 250DB超聲儀(昆山市超聲儀有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(日立公司)，0.22 μm的濾膜為Waters 公司。

1.2 藥品及試劑 喹乙醇，批號(hào)H0061103，含量99.5%，乙酰甲喹，批號(hào)H0111008，含量99.6%，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。甲酸、乙腈(色譜純，Merk，德國(guó))；超純水。高純氮，高純氬(純度均為99.99%，濟(jì)南德陽(yáng)氣體有限公司)。

1.3 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLCR BEH C18色譜柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：水溶液(0.1%甲酸)；流速：0.4mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35℃。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Progam of gradient elution

1.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子噴霧電壓：5500；離子源溫度：500 ℃；簾氣：20；霧化氣：50；加熱氣：50；測(cè)試藥物定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的去簇電壓和碰撞能量見表2

表2 質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)

1.5 樣品制備

1.5.1 陰性樣品 扶正解毒散，來(lái)源：山東天利和生物工程有限公司；批號(hào)20181101。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 精密稱取喹乙醇、乙酰甲喹10 mg(準(zhǔn)確至0.01 mg)，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。-20 ℃冰箱保存，貯存期3個(gè)月。

1.5.3 樣品溶液的制備 精密稱取1.5.1項(xiàng)下扶正解毒散0.2 g，置30 mL離心管中，加20 mL 60%乙腈，40 ℃水浴超聲處理10 min，5000 r/min離心15 min，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 mL，置50 mL容量瓶中加初始流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得空白基質(zhì)溶液。待測(cè)樣品以上法處理，作為UPLC-MS/MS供試品溶液。

1.5.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備 精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，置100 mL容量瓶中，加空白基質(zhì)溶液稀釋至刻度，搖勻，從中精密量取1 mL置50 mL容量瓶中，加空白基質(zhì)溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得100 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.5.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 上述儲(chǔ)備液(1.5.2)用初始比例流動(dòng)相稀釋，制成5、7.5、10、15、20、50、100、200ng/mL的溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.6 陽(yáng)性添加樣品的制備 精密稱取16、20、24 mg喹乙醇、乙酰甲喹加入到陰性樣品中配制成80、100、120 μg/mL的陽(yáng)性添加樣品，旋渦混勻，每種添加濃度制備3份平行樣，每份樣品至少進(jìn)樣2次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性考察 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離各離子。上述儲(chǔ)備液(1.5.2)用初始流動(dòng)性稀釋，配制成5、7.5、10、15、20、50、100、200 ng/mL的溶液，經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定后，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中喹乙醇、乙酰甲喹定量離子峰面積為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)的喹乙醇、乙酰甲喹濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖所示喹乙醇、乙酰甲喹在5～200ng/mL的范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y=0.0108X-26.509，Y=0.0032X-24.2282，其相關(guān)系數(shù)分別為R2為0.9984，R2為0.9995，線性良好。見圖1，圖2。

圖1 喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of olaquindox

圖2 乙酰甲喹標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Standard curve of mequindox

2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液2 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次。以峰面積計(jì)算，得出喹乙醇、乙酰甲喹的RSD分別是3.02%,2.16%。表明儀器精密度良好，符合檢測(cè)要求。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 同批供試品(批號(hào)為 20180201，山東某獸藥生物科技有限公司提供)，按1.5.6項(xiàng)下制備6份樣品溶液，喹乙醇、乙酰甲喹含量的RSD分別是2.92%,2.66%，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性好，含量穩(wěn)定。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1.5.6項(xiàng)下同一供試品溶液(批號(hào)：20180201)，室溫下每隔4 h連測(cè)6次，進(jìn)樣體積2 μL，喹乙醇、乙酰甲喹峰面積RSD分別為0.88%，0.92%、0.85%，表明本制劑在制備后的24 h內(nèi)成份較穩(wěn)定。

2.5 檢測(cè)限和定量限 25 μg/mL喹乙醇、乙酰甲喹對(duì)照品溶液信噪比(S/N)≥3，確定為方法的檢出限。50 μg/mL喹乙醇/乙酰甲喹對(duì)照品溶液顯示信噪比(S/N)≥10，作為此方法定量限。

2.6 方法選擇性的驗(yàn)證 選擇20個(gè)空白樣品，按照優(yōu)化條件進(jìn)行處理后上機(jī)測(cè)定，未發(fā)現(xiàn)有假陽(yáng)性結(jié)果，表明該方法的選擇性良好。

2.7 回收率試驗(yàn) 扶正解毒散中添加喹乙醇，乙酰甲喹，液質(zhì)分離良好，無(wú)干擾，添加濃度80、100、120 μg/mL，批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于10%，陽(yáng)性添加樣品的回收率在90%～103%見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 3 Result of recovery for olaquindo and mequindox

方法批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<10%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<10%。

空白樣品、對(duì)照溶液及陽(yáng)性添加樣品的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜譜圖見圖3～圖5。

圖3 100 ng/mL對(duì)照溶液提取離子色譜圖Fig 3 Extraction ion chromatograms of the contrast solution

圖4 空白樣品特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 4 Extraction ion chromatograms of the blank sample

圖5 100 ng/mL陽(yáng)性添加樣品特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 5 Extraction ion chromatograms of the positive added sample

3 討論與結(jié)論

3.1 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)選擇甲醇(0.1%甲酸)和乙腈(0.1%甲酸)為流動(dòng)相A，分別考察了甲醇-水體系和乙腈-水體系分離情況，摒棄了乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(12∶88)作為流動(dòng)相[8-9]，降低了色譜柱因磷酸鹽易堵的風(fēng)險(xiǎn)。不斷調(diào)整流動(dòng)相比列：甲醇和乙腈由30%下降到15%[10]，最終選擇了5%乙腈(0.1%甲酸)為流動(dòng)相A，不僅能使喹乙醇、乙酰甲喹很好的分離，其特征離子質(zhì)量色譜圖的峰形和分離度比好，而且降低了檢測(cè)成本，有機(jī)試劑使用量較少，保護(hù)了環(huán)境。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 選擇了多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，正離子掃描，并不斷優(yōu)化了質(zhì)譜條件：對(duì)離子源溫度、去簇電壓，碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使藥物的離子化程度達(dá)到最佳狀態(tài)。計(jì)算結(jié)果采用外標(biāo)法，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好；樣品處理簡(jiǎn)單，經(jīng)過(guò)1000倍的稀釋，上機(jī)檢測(cè)雜峰極微，無(wú)干擾，分離度好。

3.3 樣品提取溶劑、處理方法及的選擇 為確保藥品中有效成分全部溶解，保證藥物臨床有效性，分別用甲醇、乙腈、60%乙腈、5%乙腈對(duì)不同批號(hào)的樣品稀釋并超聲提取。直接采用甲醇、乙腈溶解樣品，得到供試品溶液雜質(zhì)成分多，采取HLB固相萃取柱凈化樣品[11]；過(guò)程繁瑣，上機(jī)后柱效差，所得目標(biāo)峰峰型、分離度均不理想。樣品60%乙腈超聲提取15分鐘，離心后過(guò)濾上機(jī)，雜質(zhì)干擾少，峰形對(duì)稱，喹乙醇、乙酰甲喹回收率較高。基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液采用空白基質(zhì)溶液定容，空白基質(zhì)溶液在與喹乙醇、乙酰甲喹對(duì)照品相同保留時(shí)間處，均無(wú)色譜峰出現(xiàn)，證明在很大程度上基質(zhì)效應(yīng)小，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度高。

3.4 結(jié)論 喹乙醇、乙酰甲喹在獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的質(zhì)量控制方法主要為紫外分光光度法，專屬性不強(qiáng)，且中藥組分的干擾較大，故選擇高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)中獸藥散劑中違規(guī)添加的喹乙醇、乙酰甲喹[10]；喹乙醇是一種基因毒劑、生殖誘變劑，具有致突變、致畸和致癌性。建立其它中獸藥單方或復(fù)方制劑的喹乙醇、乙酰甲喹的檢測(cè)方法，對(duì)保障人民健康，具有重要的實(shí)際意義。

綜上所述，MS串聯(lián)可解決扶正解毒散中非法添加物喹乙醇、乙酰甲喹的定性、定量問(wèn)題，消除基質(zhì)干擾，使檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。檢測(cè)限低，靈敏度高；適合批量樣品分析。其次運(yùn)行時(shí)間短，比文獻(xiàn)HPLC方法節(jié)省了大量流動(dòng)相[12-13]，經(jīng)濟(jì)可行。為治理整頓中獸藥中添加違禁藥物，嚴(yán)厲打擊違法行為，提供了檢測(cè)依據(jù)。