賀 雄，丁朝輝，周 瑚,3，朱華珺,3，李俊俊，丁宇倩，胡立冬，任佐華，劉二明,3*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 湖南 長沙 410128; 2. 植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室, 湖南 長沙 410128; 3. 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖南 長沙 410128; 4. 湖南省桃江縣農(nóng)業(yè)局植保植檢站, 湖南 桃江 413400)

【研究意義】水稻稻瘟病(Rice blast)又名稻熱病，俗稱吊頭瘟、火燒瘟、掐頸瘟，是危害水稻的三大病害之一。稻瘟病是由稻瘟病菌(有性世代Magnaportheoryzae，無性世代Pyriculariaoryzae)引起，能侵染水稻各個生育期的組織，也可以寄生在小麥、大麥和粟等多種禾本科作物及雜草上[1]。我國稻瘟病年平均發(fā)生面積為380萬hm2，而湖南稻瘟病常年發(fā)生危害面積為35萬hm2，流行年份損失稻谷兩億千克以上[2]，因此稻瘟病分布的廣泛性和危害性受到政府和科學(xué)家的廣泛關(guān)注。選育和推廣水稻抗性品種是防止稻瘟病流行和危害最經(jīng)濟、有效的策略，由于大面積推廣種植單一品種所形成的選擇壓導(dǎo)致稻瘟病菌極易產(chǎn)生新的生理小種和毒性類型，從而使抗病水稻品種在推廣種植3～5年后抗性降低甚至直接喪失抗性[3]。因此，深入了解病菌的遺傳結(jié)構(gòu)組成和無毒基因變化趨勢，對抗病品種選育及合理布局至關(guān)重要。【前人研究進展】近年來，我國多個稻區(qū)稻瘟病發(fā)生頻率持續(xù)增高，筆者所在實驗室多年來對湖南稻瘟病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)及無毒基因動態(tài)變化有持續(xù)研究。發(fā)現(xiàn)麗江新團黑谷上的稻瘟病菌遺傳具有明顯的多樣性，且其無毒基因的變異率正在逐年增高[4-5]?！颈狙芯壳腥朦c】本研究在已有的研究基礎(chǔ)上，于2017年從湖南桃江稻瘟病病圃采集了多個晚稻品種的稻瘟病標(biāo)樣，經(jīng)單包分離、純化，利用SSR分子標(biāo)記方法，分析了這些稻瘟病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的多樣性；通過無毒基因的鑒定對稻瘟病菌的致病能力以及無毒基因組成和分布進行了分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究結(jié)果將為湖南稻區(qū)選育和推廣水稻稻瘟病抗性品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SSR遺傳多樣性分析

1.1.1 供試菌株 本試驗供試稻瘟病菌株共29個，于2017年采自湖南省益陽市桃江縣稻瘟病圃(N 28°22′，E 112°03′)中多個主栽水稻品種的葉瘟和穗頸瘟感病標(biāo)樣，經(jīng)單孢分離技術(shù)[6]獲得(表1)。

1.1.2 稻瘟病菌富集培養(yǎng) 將保存在高粱粒中的稻瘟病菌接種到可溶性淀粉固體平板培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)至稻瘟病菌菌絲長滿整個平板，在體式顯微鏡下用接種針從平板外緣挑取少量附有培養(yǎng)基的菌絲接種到盛有50 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃下180 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)3～5 d。

1.1.3 DNA提取及檢測 采用試劑盒法(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取稻瘟病菌基因組DNA。

表1 供試稻瘟病菌菌株

表2 供試SSR引物

使用Nano Drop的Spectrophotometer檢測樣品DNA的純度和濃度(純DNA：OD260/OD280≈1.8，正常；>1.9，表明有RNA污染；<1.6表明有蛋白質(zhì)、酚等污染)，并調(diào)整DNA純度為150 ng/μl[7]。

1.1.4 PCR擴增 8對SSR引物：KMS02、SMS17、G5、FG01、FG02、FG03、MS355、MS677，上海生工公司(表2)。

PCR擴增程序為：①引物KMS02、SMS17、G5的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2.5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。②引物FG01、FG02、FG03的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。③引物MS355、MS677的反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.1.5 瓊脂糖凝膠電泳 利用質(zhì)量體積分數(shù)為2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。第1孔加入由3 μl Green I染料和7 μl marker制成的混合液8 μl；第2孔加由3 μl染料、2 μl Loading Buffer和5 μl ddH2O制成的混合液8 μl；第3至第25孔分別加入由3 μl染料、2 μl Loading Buffer及5 μl PCR產(chǎn)物混合而成的上樣液8 μl。在110 V電壓強度下，電泳約35 min，條帶遷移至凝膠的1/2～2/3處即可。電泳后利用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進行觀察、拍照記錄。

表3 PCR擴增體系

將SSR引物擴增電泳結(jié)果轉(zhuǎn)換為二進制數(shù)據(jù)，即有條帶的記為1，無條帶的記為0，采用DPS 7.05軟件Nei & Li最長距離法進行聚類分析。

1.2 無毒基因鑒定

1.2.1 供試材料 供試水稻：普感稻瘟病品種麗江新團黑谷(LTH)和國際水稻所培育的22個水稻抗稻瘟病近等基因系(NILs)原種由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授提供，現(xiàn)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病原微生物實驗室保存和繁殖。

供試菌株：2017年在湖南省益陽市桃江縣稻瘟病圃采樣分離純化的1～19號菌株。

1.2.2 離體接種 將供試的水稻種子浸種至露白，播于育苗盆中，以LTH作為感病對照，每盆播種4個不同的品種。在水稻1葉1心、3葉1心期各追施一次氮肥，待長至5葉期剪取葉片，參照馬軍濤[8]方法進行針刺離體接種，接種稻瘟病菌株孢子懸浮液濃度為2×100個/mL(含0.025 % Tween20)。接種后的稻苗置于28 ℃、RH為95 %的環(huán)境中暗處理24 h，隨后光暗交替(L/D = 12 h/12 h)培養(yǎng)，期間隨時觀察發(fā)病情況，4～6 d后記錄發(fā)病情況。

1.2.3 統(tǒng)計數(shù)據(jù) 當(dāng)接種葉段僅有黑褐色壞死斑或沒有病斑時為抗病反應(yīng)型記為R(圖2)；當(dāng)病斑中央灰白色、病斑較大且有黃色暈圈時為感病反應(yīng)型，記為S(圖3)。

圖1 抗病R型

稻瘟病菌群體的毒力頻率(virulence frequency，VF %) = 對測試水稻品種有毒力的菌株數(shù)/所有菌種菌株數(shù)×100 %；當(dāng)VF≥70 %時為病菌群體表現(xiàn)強毒力，50 %≤VF<70 %時為較強毒力，20 %

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物對供試菌株的擴增

不同水稻品種上分離出來的29個供試菌株和8對用于分析的SSR引物反應(yīng)體系均能有效擴增，且不同引物對供試菌株的擴增多態(tài)性不同。G5、SMS17、KMS02、FG01、FG02、FG03、MS355、MS677分別擴增出18、22、26、25、22、18、16和23條亮帶，且重復(fù)性良好，陰性對照無任何譜帶出現(xiàn)(圖3)。

2.2 桃江地區(qū)侵染不同水稻品種的稻瘟病菌群體遺傳譜系

利用8對SSR引物對侵染不同水稻品種的29個稻瘟病菌單孢菌株進行PCR擴增后的電泳結(jié)果轉(zhuǎn)換為0-1數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)分析軟件DPS7.05進行0-1數(shù)據(jù)聚類分析。

圖2 感病S型

表4 0.70相似系數(shù)下29個供試菌株的遺傳譜系

Table 4 Genetic lineage for 29 strains ofM.oryzaeunder 0.70 similarity coefficients

譜系Pedigree菌株號Isolate菌株數(shù)Sum比例( %)PercentageI1,7,8,16,29,2,5,9,23,3,15,201241.3II10,18,17310.4III19,2526.9IV2413.5V4,12,6,14,21,11,13724.1VI22,2726.9VII26,2826.9

由表4可知，在相似系數(shù)0.39，差異系數(shù)0.61水平下，29個稻瘟病菌單孢菌株被劃分在同一個宗譜內(nèi)；相似系數(shù)0.70，差異系數(shù)0.30水平下，29個供試菌株可劃分為7個宗譜，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果得知，I宗譜為優(yōu)勢宗譜，有12個菌株，占總菌數(shù)的41.3 %，V宗譜中有7個菌株，占總菌數(shù)的24.1 %，其他5個宗譜均含有1～3個菌株占總菌數(shù)的34.6 %。從聚類分析看，湖南桃江最新一批分離出來的稻瘟病菌仍然具有顯著差異性，遺傳結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，極個別菌株親緣關(guān)系遠。

2.3 無毒基因鑒定結(jié)果

通過19個菌株對19個NILs水稻品系致病能力測定，19個稻瘟病菌株對含單抗基因NILs水稻品種的致病率在35 %～75 %，強致病力菌株(PF 70 %)有3株，分別為4、8、12號菌株，占總菌數(shù)的15.7 %，；較強致病力菌株(70 %>PF≥50 %)7株，分別為3、6、7、9、10、14、16號菌株，占總菌數(shù)36.8 %；中等致病力菌株(50 %>PF≥20 %)9株，占總菌數(shù)的47.5 %；本實驗的供試菌株都表現(xiàn)出較強的致病力，沒有檢測出致病力弱的菌株。

供試菌株對18個含單抗基因的水稻品系(NILs)表現(xiàn)出不同的毒力水平，平均毒力頻率為49.86 %，其中對Pi-ks、Pi-zt、Pi-ta3個單抗瘟基因毒力頻率超過70 %，屬于強毒力。也表明這些抗性基因在桃江稻區(qū)沒有利用價值；供試菌株對Pi-kp、Pi-z5、Pi-t、Pi-sh、Pi-55個抗性基因型的毒力頻率介于50 %～70 %，具有較強的毒力，預(yù)示這些抗性基因若在該地區(qū)利用將導(dǎo)致稻瘟病流行風(fēng)險很大；其余抗性基因型的毒力頻率均低于50 %；抗性基因Pi-3、Pi-i、Pi-11、Pi-19、Pi-12抗性優(yōu)良(表5)。

M: 2000 bp DNA marker; CK: 陰性對照(ddH2O); 1～20: 菌株編號

圖4 19個稻瘟病菌株致病能力

3 討 論

本研究對分離自桃江地區(qū)的稻瘟病菌經(jīng)SSR進行分析，其在分子多態(tài)性方面的差異在相似系數(shù)0.70水平上，29個供試菌株可分為7個宗譜，優(yōu)勢宗譜占總菌數(shù)的41.3 %。不同水稻品種分離出來的菌株遺傳差異較大，這與周益軍[10]的研究結(jié)果相一致，即水稻品種的差異會對稻瘟病菌株遺傳多樣性造成比較大的影響。但是分析發(fā)現(xiàn)，源于相同栽培品種中的不同菌株之間雖存在差異但是差異較小，如12、13、14號菌株都是在湘晚秈-32上分離獲得的稻瘟病菌株，通過聚類分析這3個菌株都屬于同一個宗譜。而相同品系農(nóng)香-32分離的15、16、17號菌株以及由中早-39分離出的18、19號菌株，均與各自品系分離出的菌株不屬于同一個宗譜；這與周瑚等[5]、Ngueko等[11]以及郭麗穎等[4]的研究結(jié)果相似，這可能是因水稻品種、氣候條件、研究菌株數(shù)不夠等各方面因素存在差異而造成。

本研究結(jié)果表明，2017年湖南省桃江稻瘟病圃多數(shù)稻瘟病菌對攜帶已知抗病基因的水稻單抗病基因品系具有較強的致病力。從毒力頻率結(jié)果看，稻瘟病菌株對含單抗基因Pi-ks、Pi-zt、Pi-ta毒力頻率高達70 %以上，童建新[12]2012年研究結(jié)果表明，無毒基因Avr-Pi-ks、Avr-Pi-ta在湖南地區(qū)已經(jīng)沒有了抗性優(yōu)勢；虞選杰[13]、劉翔等[14]的2013-2014年的結(jié)果中抗性基因Pi-ks、Pi-zt毒力頻率達到80 %以上；周瑚等[5]研究表明，2015年抗瘟基因Pi-zt毒力頻率達到85 %。綜合表明Pi-ks、Pi-zt、Pi-ta3個抗性基因基本喪失對桃江病圃稻瘟病菌的抗性。湖南桃江稻區(qū)不能再將抗瘟基因Pi-ks、Pi-zt、Pi-ta作為抗源基因使用。抗性基因Pi-kp、Pi-z5、Pi-t、Pi-sh、Pi-5毒力頻率介于50 %～70 %之間，毒力較強，與周瑚等[5]2016年的結(jié)論大致相同。說明近幾年這些抗性基因的抗性可能會進一步喪失，在選育抗病水稻品種時與之相對應(yīng)的抗性品種在湖南地區(qū)需要慎重使用；其余無毒基因的毒力頻率低于50 %，水稻品種對其表現(xiàn)較好的抗性，Pi-i、Pi-3、Pi-11、Pi-12、Pi-19抗性優(yōu)良，與童建新[12]的2012年研究結(jié)果Pi-zt、Pi-1、Pi-3、Pi-7表現(xiàn)出良好的抗性結(jié)果相差較大。Pi-zt、Pi-1、Pi-73個抗瘟基因在桃江稻區(qū)抗性已經(jīng)逐年喪失；只有Pi-3仍可作為有效的抗瘟基因。此外，趙正洪等[15]研究表明，Pi-1和Pi-k2個抗瘟基因抗性優(yōu)良，可直接作為湖南省稻瘟病的抗源基因，Pi-ta、Pi-3、Pi-12雖仍具有較強抗性，但是抗病能力正逐步喪失。本研究結(jié)果表明，湖南桃江稻區(qū)Pi-1和Pi-k2個抗瘟基因正逐步感病化，Pi-ta的抗性已經(jīng)喪失，Pi-3、Pi-12可作為抗性基因。謝倩鳳等[16]2015年的研究顯示，廣州地區(qū)攜帶Pi-ta基因位點的供試材料比例為54.9 %和76.8 %，其出現(xiàn)頻率相對較高，但在以YL155/YL87 標(biāo)記檢測到Pi-ta基因的材料中，少數(shù)材料以ta5 標(biāo)記檢測不到Pi-ta基因。這說明廣州地區(qū)Pi-ta雖保持較好抗性，但是有潛在感病化風(fēng)險。綜上，體現(xiàn)稻瘟病菌遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜，水稻抗瘟基因的抗性隨著時間的推移波動，且幅度較大，這可能是由于單一水稻品種栽培多年而導(dǎo)致稻瘟病菌產(chǎn)生新的毒力小種使水稻抗性逐漸喪失。

表5 19個單孢菌株對個NILs的毒力頻率

4 結(jié) 論

湖南桃江病圃稻瘟病菌群體具有豐富的遺傳多樣性，而且存在復(fù)雜的致病性分化，在稻瘟病菌和水稻品種共同進化過程中，稻瘟病菌的無毒基因組成會隨著水稻抗瘟基因的變化而產(chǎn)生新的毒力小種，從而導(dǎo)致水稻抗瘟性喪失。因此，只有不斷淘汰已失去抗性的抗瘟基因水稻品種，引進含新的抗瘟基因水稻品種，并使多個抗病基因聯(lián)合抗病，才能長期有效的控制水稻稻瘟病的發(fā)生。