王 慧，白 禹，楊文佳，李國(guó)勇，駱建林，曹 禹，李 燦

(貴陽(yáng)學(xué)院貴州省大鯢可持續(xù)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州省山地珍稀動(dòng)物與經(jīng)濟(jì)昆蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550005)

【研究意義】近年來(lái)，大鯢(Andriasdavidianus)細(xì)菌性病害頻發(fā)，特別是弗氏檸檬酸桿菌引起的敗血癥[1]?？咕姆植加诖篥F多個(gè)組織器官，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用，研究抗菌肽家族基因在病原菌侵染大鯢時(shí)的表達(dá)響應(yīng)，對(duì)揭示分子層面的互作機(jī)制和控制疾病具有重要意義[2-4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大鯢屬于有尾目(Caudata)隱鰓鯢科(Cryptobranchidae)大鯢屬(Andrias)，是目前現(xiàn)存兩棲動(dòng)物中個(gè)體最大，最珍貴的物種，被國(guó)家認(rèn)定為二級(jí)野生保護(hù)動(dòng)物。1978年，大鯢首次人工繁殖成功后，其人工養(yǎng)殖規(guī)模逐漸加大，貴州是大鯢人工養(yǎng)殖和繁育的主要地區(qū)之一，但大鯢在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受細(xì)菌、病毒和寄生蟲的危害，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，特別是弗氏檸檬酸桿菌，導(dǎo)致幼鯢發(fā)病，患病大鯢出現(xiàn)不良或拒食等癥狀，后期出現(xiàn)頭部、腹部腫大，皮下出血，最終死亡，會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失?？咕?Antimicrobial peptide，AMPs)是機(jī)體免疫防御外界微生物入侵的重要屏障，具有廣譜抗菌、強(qiáng)堿性等一系列特點(diǎn)?？咕呐c細(xì)菌侵染的作用機(jī)制是抗菌肽直接作用于細(xì)菌的膜上，并形成跨膜的離子通道，造成細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物泄露，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，達(dá)到防御細(xì)菌侵染，發(fā)揮機(jī)體免疫的作用[5-6]。【本研究切入點(diǎn)】目前，研究抗菌肽與細(xì)菌互作機(jī)制主要集中在蛙類、魚類等，大鯢抗菌肽與細(xì)菌的作用機(jī)制研究較少，特別是研究抗菌肽基因在細(xì)菌侵染后的表達(dá)響應(yīng)及調(diào)控更少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】2017年12月至2018年7月筆者在貴陽(yáng)學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，從大鯢不同組織部位對(duì)抗菌肽家族基因響應(yīng)弗氏檸檬酸桿菌侵染入手，在不同時(shí)間檢測(cè)基因的表達(dá)量變化，揭示大鯢抗菌肽與細(xì)菌的互作機(jī)制提供理論依據(jù)，為養(yǎng)殖實(shí)踐中大鯢的免疫防御提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 弗氏檸檬酸桿菌與大鯢幼苗 弗氏檸檬酸桿菌，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。大鯢幼苗，購(gòu)自貴州省翔盛大鯢繁養(yǎng)有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒，購(gòu)自北京全式金試劑有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自TAKARA公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，購(gòu)自北京全式金試劑有限公司。

1.1.3 儀器 BIO-RAD Gel DOCTM型凝膠成像儀，雪科IMS-130全自動(dòng)雪花制冰機(jī)，Thermo 900 series超低溫冰箱，BIO-GEN MIlli-Qirect 16 超純水儀，博訊SW-CJ-1FD垂直超凈工作臺(tái)，RAY LEIGH UV18-01分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的配制 將弗氏檸檬酸桿菌接種于LB平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD600=0.6，濃度為1×108CFU/mL。

1.2.2 大鯢病原菌接種試驗(yàn) 供試大鯢250～300 g，分為4組，每組15尾，暫養(yǎng)1周后無(wú)任何病變可用于接種試驗(yàn)。第1組為對(duì)照組，接種1×PBS 0.5 mL/尾，第2組接種弗氏檸檬酸桿菌0.5 mL/尾。接種后0、12、24、36、48 h，分別從對(duì)照組和試驗(yàn)組中各取3尾大鯢，無(wú)菌解剖后取皮膚、肝臟和脾臟組織速凍于液氮中備用[7]。

1.2.3 RNA提取與cDNA的合成 凍存組織采用Trizol抽提總RNA，步驟參照Trizol試劑盒說(shuō)明書。提取后用1 %瓊脂糖凝膠電泳電泳25 min，檢測(cè)總RNA質(zhì)量；用核酸蛋白儀(Eppendorf)檢測(cè)總RNA的濃度，OD260/OD280值在1.8～2.0為合格樣品。反轉(zhuǎn)錄使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒RT reagent Kit (perfect Real Time，Takara)進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中向樣品總RNA中加入1 μl DNA-Eraser后置于PCR儀中42 ℃、2 min。隨后，加入反轉(zhuǎn)錄復(fù)合物和引物進(jìn)行混合，混合終體積為10 μl，樣品混勻后在PCR儀37 ℃、15 min，85 ℃、5 s進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。cDNA反轉(zhuǎn)后儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱，保存待用。

1.2.4 RT-PCR qRT-PCR采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，在Bio-rad CXF96熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，步驟參照說(shuō)明書，引物序列見表1。反應(yīng)體系20 μl：SYBR Green PCR Mix 10 μl，上下游引物各1 μl(濃度為10 μmol/L)，cDNA模板1 μl，ddH2O 7 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃變性 15 s；55 ℃退火延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)；65 ℃采集熒光信號(hào)。每個(gè)樣品重復(fù)3次[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)量采用2-△△Ct法，基因的相對(duì)表達(dá)量=處理樣品(目的基因CT值-actinCT值)-0 h樣品(目的基因CT值-actinCT值)。用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異顯著；用軟件SigmaPlot 12.5制圖。

2 結(jié)果與分析

表1 qRT- PCR的檢測(cè)基因和內(nèi)參基因引物序列

Table 1 qPCR primer sequences of tested genes and internal reference genes

基因名稱 Gene name引物序列(5′-3′) Primer sequenceAdCath 1F:TCAGTTCAGCCCAGGAAACTR:GGCACACGGTCTCTTTGATTAdCath 5F:CATGGCATCGGTTATTGACAR:CGCACTCTTCAGGGTTTCTCAdCath 8F:ACTCTGGCACAGGAGGAAGAR:GAGGCAGTGCGTGATAGTGARPL13F:CCATGGTGGCTAAGCAAGTTR:TGTGAGGCAGCATACCTCTGEF1-αF:GGACAGACCCGTGAACATGCR:CTTCCTTAGTGATCTCCTCGTAGC

注：AdCath1，AdCath5，AdCath8為課題組前期分析大鯢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)比后獲得的抗菌肽家族基因。

Note:AdCath1,AdCath5, andAdCath8are the research group's pre-analytic data ofA.davidianustranscriptome, and the antibacterial peptide family genes are obtained after comparison.

圖1 大鯢總RNA電泳檢測(cè)圖譜

2.1 RNA質(zhì)量

對(duì)大鯢皮膚，肝臟和脾臟抽提的RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，清晰可見RNA的2條主帶28SrRNA和18SrRNA(圖1)，表明提取的總RNA分子完整性好，可以用于下一步試驗(yàn)。

2.2 大鯢皮膚組織抗菌肽家族基因?qū)Ωナ蠙幟仕釛U菌的響應(yīng)表達(dá)

從圖2看出，在大鯢皮膚組織中抗菌肽基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在不同時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá)，其中，AdCath1表達(dá)量在12～48 h相較于0 h表達(dá)上調(diào)，且與對(duì)照組(1×PBS)相比，弗氏檸檬酸桿菌處理上調(diào)顯著，在36 h時(shí)AdCath1表達(dá)量是對(duì)照的92.35倍。AdCath5 在24～48 h弗氏檸檬酸桿菌處理的表達(dá)顯著高于對(duì)照，但12 h時(shí)顯著低于對(duì)照，表明AdCath5 對(duì)弗氏檸檬酸桿菌處理積極響應(yīng)調(diào)控，24 h時(shí)響應(yīng)更明顯。AdCath8在不同時(shí)間點(diǎn)均積極響應(yīng)表達(dá)調(diào)控，在36 h時(shí)弗氏檸檬酸桿菌處理的表達(dá)量顯著高于對(duì)照18.58倍。

2.3 大鯢肝臟組織抗菌肽家族基因?qū)Ωナ蠙幟仕釛U菌的響應(yīng)表達(dá)

從圖3看出，在大鯢肝臟組織中抗菌肽基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在不同時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá)，其中，AdCath1表達(dá)量在12～48 h相較于0 h表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照相比，弗氏檸檬酸桿菌處理的上調(diào)顯著，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸升高，在48 h時(shí)表達(dá)量是對(duì)照的52.99倍。AdCath5在24～48 h弗氏檸檬酸桿菌處理的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，在24 h時(shí)表達(dá)量是對(duì)照的5.53倍，表明AdCath5對(duì)弗氏檸檬酸桿菌積極響應(yīng)調(diào)控。AdCath8在不同時(shí)間點(diǎn)積極響應(yīng)表達(dá)調(diào)控，隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量上調(diào)更明顯，在48 h弗氏檸檬酸桿菌處理的表達(dá)量是對(duì)照的7.38倍。

2.4 大鯢脾臟組織抗菌肽家族基因?qū)Ωナ蠙幟仕釛U菌的響應(yīng)表達(dá)

從圖4看出，在大鯢脾臟組織中抗菌肽基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在不同時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá)，其中AdCath1和AdCath8在12～48 h相較于0 h表達(dá)量上調(diào)，與對(duì)照組相比，弗氏檸檬酸桿菌處理的上調(diào)顯著，在24 h時(shí)表達(dá)量上調(diào)最明顯，分別是對(duì)照組的5.70和8.06倍。AdCath5在48 h時(shí)表達(dá)量最高，弗氏檸檬酸桿菌處理的表達(dá)量是對(duì)照組的2.61倍，24 h時(shí)是對(duì)照組的8.00倍。

圖2 大鯢抗菌肽基因AdCath 1、AdCath 5和AdCath 8不同時(shí)間點(diǎn)皮膚相對(duì)表達(dá)量

圖3 大鯢抗菌肽基因AdCath 1、AdCath 5和AdCath 8不同時(shí)間點(diǎn)肝臟相對(duì)表達(dá)量

圖4 大鯢抗菌肽基因AdCath 1、AdCath 5和AdCath 8不同時(shí)間點(diǎn)脾臟相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

抗菌肽具有廣譜的抗菌性，且活性較高，如一種抗菌肽可抑制和殺死多種致病病菌，包括革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)[9-10]。因此，從抗菌肽的分子水平入手，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得大鯢抗菌肽家族3個(gè)基因(AdCath1、AdCath5、AdCath8)的全長(zhǎng)，研究其與病原菌互作過(guò)程中發(fā)揮的作用。檸檬酸桿菌是一種革蘭氏陰性菌(G-)，可侵染大鯢，誘發(fā)病害及死亡，對(duì)大鯢資源保護(hù)及馴養(yǎng)繁殖造成嚴(yán)重的危害，研究檸檬酸桿菌與抗菌肽互作的分子機(jī)制迫在眉睫。

qRT-PCR方法廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域，且具有檢測(cè)快速、高靈敏度檢出等特點(diǎn)。通過(guò)qRT-PCR方法分析弗氏檸檬酸桿菌侵染不同時(shí)間點(diǎn)大鯢3個(gè)抗菌肽家族基因的響應(yīng)，使用熒光嵌合法，對(duì)抗菌肽基因的表達(dá)量進(jìn)行準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快速，且國(guó)內(nèi)外多篇文獻(xiàn)均使用此方法進(jìn)行基因表達(dá)分析[11]。結(jié)果表明，抗菌肽家族基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在弗氏檸檬酸桿菌誘導(dǎo)后，不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，且均高于1×PBS處理后的表達(dá)量，表明抗菌肽家族3個(gè)基因積極響應(yīng)弗氏檸檬酸桿菌的侵染，對(duì)病原菌的侵染作出積極的調(diào)控。

大鯢人工養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展已有幾十年，但是涉及病害的研究較少，目前大鯢病害的研究主要集中在虹彩病毒引發(fā)的潰爛和出血等[12]，細(xì)菌病研究較少，特別是分子水平的研究。因此，從抗菌肽家族基因的分子機(jī)制出發(fā)，研究在細(xì)菌與寄主(大鯢)互作中抗菌肽基因的調(diào)控。目前，抗菌肽功能的研發(fā)已經(jīng)成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，如新藥的開發(fā)，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用，在飼料中添加抗菌肽作為抑菌劑等。此研究可進(jìn)一步彌補(bǔ)大鯢抗菌肽研究的空白，為病原菌和大鯢的互作機(jī)制提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

抗菌肽家族基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在弗氏檸檬酸桿菌侵染大鯢的不同時(shí)間點(diǎn)均發(fā)揮著積極的調(diào)控作用，呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的普遍趨勢(shì)，表明抗菌肽家族基因在病害侵染中起著積極的免疫作用。研究結(jié)果為大鯢抗病研究機(jī)制中抗菌肽的開發(fā)和應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。