沈琦，孫筱君，吳逸飛，姚曉紅，李園成，孫宏，王新，湯江武*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

由于畜禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，畜禽糞污所產(chǎn)生的惡臭、氮磷、添加劑及重金屬污染日益嚴(yán)重，已經(jīng)威脅到農(nóng)業(yè)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展，畜禽糞污已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)面源污染的主要來(lái)源之一[1]，產(chǎn)生的惡臭氣體對(duì)周?chē)h(huán)境及居民的生活造成了嚴(yán)重影響。畜禽糞污產(chǎn)生的惡臭氣體主要成分為氨、揮發(fā)性含硫化合物、揮發(fā)性脂肪酸、吲哚類(lèi)和酚類(lèi)[2]，不僅對(duì)人類(lèi)嗅覺(jué)產(chǎn)生心理厭惡等不愉快的感覺(jué)外，還會(huì)對(duì)人和動(dòng)物的呼吸、消化、神經(jīng)系統(tǒng)等造成不同程度的毒害[3]。因此，進(jìn)行畜禽糞污的除臭研究變得尤為迫切。

惡臭氣體的常見(jiàn)處理方法有物理法、化學(xué)法和生物法，其中生物法通過(guò)微生物的生理代謝過(guò)程來(lái)降解惡臭物質(zhì)，具備投資少、費(fèi)用低、操作方便且不會(huì)造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)[4]，已經(jīng)成為現(xiàn)階段畜禽糞污除臭研究的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，氨氣和硫化氫是最主要的惡臭物質(zhì)，氨氣的揮發(fā)量與糞污中其他致臭物質(zhì)高度相關(guān)，減少氨氣的揮發(fā)可以有效降低糞污惡臭[5]，因而篩選高效的氨氣同化微生物及硫化氫同化微生物，進(jìn)行生物脫臭，可以有效控制畜禽糞污產(chǎn)生的惡臭。本試驗(yàn)從浙江省某養(yǎng)豬場(chǎng)的糞污及周?chē)寥乐蟹蛛x除臭微生物，以期用于畜禽糞污的除臭，豐富臭氣治理的菌種庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本采集于浙江省內(nèi)的3個(gè)大型養(yǎng)豬場(chǎng)，樣本為不同養(yǎng)豬場(chǎng)中豬的糞便、豬糞周?chē)寥?，各樣本采集約50 g。將不同地點(diǎn)采集的同種樣本均勻混合后放入冰盒中保存，備用。商品菌劑(LD)購(gòu)自福建洛東生物技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)用培養(yǎng)基配方如下。YPD培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，葡萄糖20.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0；LB培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0；PDA培養(yǎng)基：土豆200.0 g，蔗糖20.0 g，酵母膏2.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，硫酸鎂1.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0；NH3選擇性培養(yǎng)基：蔗糖50.0 g，氨水10.0 mL，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.1 g，1% ZnSO45.0 mL，NaCl 2.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0；H2S選擇性培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g，K2HPO40.5 g，KNO31.0 g，MgCl20.5 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 0.5 g，Na2CO31.0 g，F(xiàn)eCl20.01 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0；分離純化培養(yǎng)基：KH2PO42.0 g，NH4Cl 0.4 g，Na2CO30.4 g，MgCl2·6H2O 0.2 g，加蒸餾水至1 000 mL，2%瓊脂。

1.3 方法

1.3.1 菌種的富集馴化

各取5 g風(fēng)干樣本分別接入100 mL NH3和H2S選擇性培養(yǎng)基，30 ℃、220 r·min-1搖床培養(yǎng)，2 d后更換培養(yǎng)基，吸取10 mL馴化培養(yǎng)液加入100 mL新鮮的選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)行第2代馴化，連續(xù)富集馴化4次。

1.3.2 菌種的分離純化

取富集液10 mL于盛有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩20 min，靜置1 min。用10倍稀釋法，將不同梯度的稀釋液涂布于氨氣和硫化氫的選擇性培養(yǎng)基。取0.2 mL菌液分別涂布在不同的固體分離平板培養(yǎng)基上，設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3～5 d將分離平板中的菌落采用平板劃線(xiàn)法進(jìn)一步純化，將特征不同的菌落分別接種于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，保存?zhèn)溆茫羧》蛛x后的菌株接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基上，30 ℃、220 r·min-1搖床擴(kuò)大培養(yǎng)3 d。

1.3.3 除臭菌株的初篩

取新鮮的豬糞200 g置于1 000 mL大燒杯中，按照3%的接種量將菌液接種于燒杯中，用玻璃棒將培養(yǎng)液與豬糞混合均勻，密封燒杯，對(duì)照組(CK)為等量的無(wú)菌水，每組3個(gè)重復(fù)，30 ℃靜止培養(yǎng)7 d，通過(guò)感官方法判斷微生物的除臭效果。感官法判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：0級(jí)，未聞到任何氣味，無(wú)任何反應(yīng)；1級(jí)，勉強(qiáng)聞到氣味，但不明顯；2級(jí)，聞到較弱氣味；3級(jí)，很容易聞到氣味；4級(jí)，臭味很大，想離開(kāi)；5級(jí)，臭味極強(qiáng)，立即離開(kāi)。

1.3.4 除臭菌株的復(fù)篩

選擇初篩中具有較好除臭效果的菌株進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)，以5%接種量將菌株接種至相應(yīng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)成菌液。稱(chēng)取500 g新鮮豬糞放入2 L大燒杯中，按照3%接種量接種菌液到燒杯中，用玻璃棒充分混勻，同時(shí)以加等量無(wú)菌水處理作為空白對(duì)照組。在大燒杯中放置2個(gè)50 mL小燒杯，一個(gè)裝有20 mL硼酸吸收液，用于吸收氨氣，另一個(gè)裝有20 mL鋅銨絡(luò)鹽溶液，用于吸收硫化氫。大燒杯用雙層保鮮膜封口，靜置培養(yǎng)，第7天取出吸收液，利用硼酸吸收凱氏定氮法[7]和鋅銨絡(luò)鹽比色法[8]分別測(cè)定氨氣和硫化氫釋放量，每組重復(fù)試驗(yàn)3次，取出后放置新的吸收液。處理組與空白對(duì)照組進(jìn)行差異顯著性分析，計(jì)算氨氣與硫化氫的降解率，確定臭氣降解率較高的除臭菌株。

1.3.5 除臭菌株的鑒定

通過(guò)2次篩選試驗(yàn)，對(duì)具有明顯抑制臭氣釋放的菌株進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察及分子鑒定。將菌懸液劃線(xiàn)到PDA培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察。挑取菌落加入裝有PCR反應(yīng)體系的PCR管中，進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，然后將目的片段送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，所得結(jié)果在GeneBank上進(jìn)行同源性比對(duì)分析，所用引物為原核生物16S rRNA PCR通用引物(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′；R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.6 除臭效果檢測(cè)

稱(chēng)取1 kg新鮮豬糞置于10 L大桶中，按照1%、3%和5%的接種量接種Z2菌液，上方放置2個(gè)100 mL燒杯，分別裝有50 mL硼酸吸收液和50 mL鋅銨絡(luò)鹽溶液，同時(shí)以加等量無(wú)菌水作為空白對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。大桶用保鮮膜及塑料膜封口，室溫靜置培養(yǎng)，第7天和第14天分別測(cè)定氨氣和硫化氫的釋放量，與對(duì)照組進(jìn)行分析，計(jì)算菌株對(duì)氨氣和硫化氫的降解率。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 除臭菌株的初篩

經(jīng)過(guò)氨氣和硫化氫選擇性培養(yǎng)基的富集馴化后，通過(guò)劃線(xiàn)法分離菌株，共分離得到12株可以同化氨氣或硫化氫的菌株(表1)，分別命名為Z1-Z4、S1-S5、Y3、Y6和GH。對(duì)分離得到的各菌株進(jìn)行初步去除氨氣和硫化氫的試驗(yàn)，根據(jù)感官篩選法，12株菌株中Z2的除臭能力最強(qiáng)，處理后惡臭強(qiáng)度級(jí)別為“0”；S1、Z3、Y3、Y6、GH的除臭能力次之，處理后惡臭強(qiáng)度級(jí)別為“1”。選擇S1、Z2、Z3、Y3、Y6、GH菌株進(jìn)行復(fù)篩。

表1 除臭菌株的感官評(píng)級(jí)

2.2 除臭菌株的復(fù)篩

對(duì)初篩得到的6株除臭菌株進(jìn)行復(fù)篩，計(jì)算第7天和第14天各菌株對(duì)氨氣和硫化氫的降解率，同時(shí)與商品菌劑(LD)的除臭效果作比較。

圖1結(jié)果可以看出，在初篩中表現(xiàn)出較好除臭能力的菌株在復(fù)篩實(shí)驗(yàn)也有一定的除臭能力。大部分菌株對(duì)氨氣的降解率要高于對(duì)硫化氫的降解率；氨氣的降解率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)略有提高，硫化氫的降解率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)略有下降。菌株Z2、Z3和GH的除臭效果均優(yōu)于商品化菌劑LD。綜合分析菌株對(duì)氨氣和硫化氫的降解率，菌株Z2的除臭效果最好。

圖1 除臭菌株的硫化氫、氨氣降解率

2.3 除臭菌種的鑒定

2.3.1 除臭菌株Z2的菌落形態(tài)特征

將Z2菌株劃線(xiàn)接種于PDA培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h。經(jīng)恒溫培養(yǎng)后，長(zhǎng)成0.5～1.0 mm白色菌落，菌落米黃色不透明，圓形低平，邊緣整齊，濕潤(rùn)且扁平(圖2)。顯微鏡下觀(guān)察到菌體呈桿狀，形成芽孢(圖3)。

2.3.2 Z2菌株的16S rRNA基因序列分析

經(jīng)16S rRNA基因序列分析，所獲得的高效糞污除臭菌株Z2與彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)的相似性水平達(dá)98%，結(jié)合細(xì)胞、菌落形態(tài)試驗(yàn)結(jié)果，可基本確定Z2為彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)。

圖2 Z2菌落的形態(tài)特征

2.4 不同接種量對(duì)Z2菌株除臭效果的影響

如圖4所示，氨氣的降解率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，第14天時(shí)最高；硫化氫的降解率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，在第7天最高。接種量為1%～3%范圍內(nèi)時(shí)，菌株對(duì)氨氣的去除率隨著添加量的增大而增大；菌株對(duì)硫化氫的降解率與接種量無(wú)關(guān)。

圖4 不同接種量對(duì)氨氣、硫化氫的降解效果

3 討論

畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的惡臭主要來(lái)源于畜禽糞污。本研究從養(yǎng)殖場(chǎng)的土壤和糞便采樣進(jìn)行除臭微生物篩選，提高了篩選的概率和針對(duì)性。通過(guò)馴化富集得到了12株可以同化氨氣或硫化氫的菌株，經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩，獲得6株具備除臭能力的菌株，其中菌株Z2可以同時(shí)高效去除氨氣和硫化氫。通過(guò)對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，包括形態(tài)學(xué)觀(guān)察及16S rRNA基因分析，確定該菌株為彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)。采用小試試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)豬糞具有較好的除臭效果，且接種量?jī)H需1%～5%，在畜禽糞污除臭方面具有較好的應(yīng)用前景。同時(shí)可以耐受高溫的菌株，在堆肥實(shí)踐中具有較好的應(yīng)用價(jià)值[9]，菌株Z2由于可以產(chǎn)生芽孢耐受高溫，因而其在堆肥中也可以應(yīng)用。

畜禽糞污產(chǎn)生的臭氣成分復(fù)雜，單一菌株通常難以實(shí)現(xiàn)對(duì)多成分臭氣的高效去除，因而除臭菌群的篩選往往成為研究熱點(diǎn)[10]。本試驗(yàn)得到的菌株Z2對(duì)氨氣和硫化氫均可以去除，但是小試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Z2對(duì)硫化氫的降解率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有明顯的下降。因此，后續(xù)研究將篩選可以持續(xù)高效去除硫化氫的菌株，并與菌株Z2進(jìn)行復(fù)配制備成高效的除臭菌劑，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行深入的探討。