賀占雪，澤桑梓，楊斌，趙寧*

(1.西南林業(yè)大學，云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224； 2.云南省林業(yè)有害生物防治檢疫局，云南 昆明 650051)

核桃(JuglansregiaL.)是重要堅果和木本油料樹種[1]，同時也是重要的經(jīng)濟生態(tài)樹種之一，與榛子、扁桃和腰果并稱為世界著名的“四大干果”[2]，具有豐富的營養(yǎng)價值和良好的醫(yī)療保健效果，深受人們喜愛。隨著經(jīng)濟和社會的發(fā)展，核桃產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟價值不斷突顯，受到外界關(guān)注度日益增長，提高核桃的豐產(chǎn)性、早實性、堅果品質(zhì)、抗逆性、抗病性和砧木改良已成為我國核桃育種的目標[3]。近年來，云南核桃的種植面積不斷擴大，在全國核桃生產(chǎn)中占有重要地位。但隨著種植面積的增大，核桃種質(zhì)資源交流的頻繁進行和核桃產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，病蟲害對核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的影響也逐漸加深。相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示，云南核桃種植中有害生物的危害面積超過6.7萬hm2，其中病害面積高達4.4萬hm2。核桃病害直接影響了核桃的質(zhì)量、產(chǎn)量和農(nóng)戶的經(jīng)濟收入。本研究對云南主栽的31個核桃品種對葉斑病抗性進行初步測定和評估，以期為生產(chǎn)中綠色防治提供科學依據(jù)，并為今后核桃抗病品種的選育和核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供參考。

葉點霉屬真菌危害植物葉片、莖和根等部位，是農(nóng)作物、林木、經(jīng)濟作物和觀賞植物的主要病原菌[4-5]，可引起多種植物的葉斑病[6-10]。該病菌主要侵染核桃葉片，發(fā)病初期在葉基部和葉脈基部形成圓形病斑，隨著感病程度逐漸加強，葉片會出現(xiàn)退綠、脫落等現(xiàn)象[11-12]，病情嚴重時，造成植株早期落葉，花、果腐爛，嚴重影響核桃產(chǎn)量。秦恩華等[13]對梔子病葉分離鑒定得出，引起梔子葉斑病的病原菌為Phyllostictagardeniicola；練啟仙等[14]報道，葉點霉屬真菌PhyllostictaglycinesThum.是引起砂仁葉斑病的主要病原菌；張格杰等[15]對大花黃牡丹葉斑病病原分離鑒定，得到引起該病的病原菌為Phyllostictacommonsii；王曉梅等[16]對桂花葉斑病病葉進行病原分離鑒定，得出病原菌為PhyllostictaghaesembillaeKoorders。

云南地形和氣候特殊多變，核桃葉部真菌病害也有多種，項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，Phyllostictajuglandis(DC.)Sacc是引起核桃葉斑病病害的病原菌。目前，國內(nèi)外對核桃葉斑病的防治主要采用物理剪除、化學防治和培育抗病品種等3種方法，但物理剪除和化學防治均存在弊端，因此，培育抗病品種是防治葉斑病經(jīng)濟有效的方法。

抗病性鑒定是抗病育種工作的重要環(huán)節(jié)。本試驗采用室內(nèi)病原離體接種的方法，對云南主栽的31個核桃品種對葉斑病菌Phyllostictajuglandis的抗性進行了初步測定和評估，在初步篩選出抗性品種的基礎(chǔ)上，分析31個核桃品種的不同抗性差異，并采用病害分級和聚類分析的方法，對核桃的抗感病性進行綜合評價，篩選出抗病品種和綜合性狀優(yōu)良的核桃品種，為云南核桃抗病優(yōu)良品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

接種材料葉片采自大理白族自治州林業(yè)科學研究所核桃種質(zhì)資源采集圃的大泡核桃、青皮大泡、小泡核桃、紙皮核桃、細皮核桃、小胖若核桃、三臺核桃、方殼核桃、娘青核桃、大木瓜核桃、扎343、新翠豐、新新2號、新早豐、小圓果、圓菠蘿、桐子果、夾棉大麻、夾棉小麻、漾雜1號、漾雜2號、漾雜3號、漾江1號、云新云林、云新高原、云新90301、云新90303、云新90306、大包殼、大尖嘴、四方果等不同核桃品種的嫩葉。

參照趙梓岑等[17]獲取核桃炭疽病病原菌的方法，得到試驗所需核桃葉斑病胡桃葉點霉屬病原菌(Phyllostictajuglandis(DC.)Sacc)。

1.2 方法

1.2.1 菌株培育及接種材料處理

選取致病性測定過程中致病能力較強的胡桃葉點霉菌株，在用PDA培養(yǎng)基在25 ℃條件下培養(yǎng)5 d后，選擇菌落中邊緣菌絲生長能力較強的地方，用3 mm打孔器取菌餅，對照采用無菌PDA菌餅。

按規(guī)格摘取寬4～5 cm、長10～12 cm核桃嫩葉，先用自來水清洗表面的灰塵，再用75%酒精表面消毒，然后用無菌水沖洗3次，晾干水分，使用石英砂在葉片表面固定部位摩擦，造成輕微傷口，備用。

1.2.2 離體接種

在無菌操作臺上進行離體接種，每種材料設10個重復和1個對照。將PDA上活化后的胡桃葉點霉病菌菌餅反扣在處理好的核桃嫩葉傷口處，在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進行培養(yǎng)，對照接種無菌PDA。接種后置于25 ℃、相對濕度90%的恒溫恒濕生化培養(yǎng)室內(nèi)黑暗培養(yǎng)，每天觀察記錄接種葉片病斑的發(fā)展情況，于接種后3 d開始，用游標卡尺對發(fā)病部位進行縱橫徑測量，取均值計算其病斑面積。

1.2.3 抗性評價

根據(jù)系統(tǒng)聚類分析結(jié)果，選擇最適聚類距離為分割點，得出最適聚類分析結(jié)果，以此為依據(jù)，并結(jié)合病害分級標準，對云南31個主栽核桃品種抗Phyllostictajuglandis(DC.)Sacc進行分析評價。

病害分級標準參照張小艷等[18]對枇杷葉斑病研究的病斑分級標準，有修改。1級，病斑面積占葉面積的比率<5%；2級，病斑面積占葉面積的比率5%～10%；3級，病斑面積占葉面積的比率10%～20%；4級，病斑面積占葉面積的比率20%～50%；5級，病斑面積占葉面積的比率≥50%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 23.0數(shù)據(jù)分析軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)的聚類分析，將病斑面積均值進行對數(shù)轉(zhuǎn)換、標準化轉(zhuǎn)換等6種處理，聚類距離采用歐式距離，聚類方法采用組間聯(lián)系、組內(nèi)聯(lián)系、最近鄰元素、最遠鄰元素、質(zhì)心聚類、中位數(shù)聚類、瓦爾德法等7種方法，采用不同的聚類分析方法和聚類距離分別組合進行數(shù)據(jù)分析，依據(jù)接種后的病斑面積均值結(jié)合聚類分析結(jié)果，篩選出與此次試驗最相符的聚類分析方法，并以譜系圖的形式展現(xiàn)聚類結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種胡桃葉點霉后的病斑大小差異

31個品種的核桃嫩葉接種胡桃葉點霉5 d后的病斑面積見表1。不同品種對胡桃葉點霉抗性能力存在差異。31個品種的核桃嫩葉接種胡桃葉點霉后，紙皮核桃、云新高原2個品種均未發(fā)病；夾棉大麻病斑面積最小，為0.6 mm2；圓菠蘿病斑面積最大，為1 175.00 mm2。

根據(jù)接種后病斑大小的次數(shù)分布圖(圖1)可以看出，31個核桃品種中，平均病斑面積為0～200 mm2有28個品種，平均病斑面積為200～400 mm2的僅有扎343，平均病斑面積為800～1 000 mm2的僅有新早豐，平均病斑面積為1 000～1 200 mm2的僅有圓菠蘿。

2.2 接種胡桃葉點霉后的抗性分級

對接種病原菌后的病斑面積數(shù)據(jù)進行聚類分析，以歐式距離2.5作為聚類分割點，將31個核桃品種分為5類(圖2)。第1類有16個抗病品種，包括云新高原、紙皮核桃、夾棉大麻、小泡核桃、漾雜1號、細皮核桃、大木瓜核桃、娘青核桃、大包殼、桐子果、四方果、夾棉小麻、青皮大泡、新翠豐、大泡核桃、新新2號；第2類有7個中抗品種，包括云新云林、云新90303、小胖若核桃、方殼核桃、漾雜2號、大尖嘴、小圓果；第3類有6個中感品種，包括漾雜3號、云新90306、三臺核桃、云新90301、漾江1號、扎343；第4類僅有1個感病品種新早豐；第5類亦僅有1個高感品種圓菠蘿。

表1 不同核桃品種接種胡桃葉點霉后嫩葉病斑的大小

圖1 接種胡桃葉點霉后不同核桃品種病斑 面積大小的次數(shù)分布

圖2 不同核桃品種對胡桃葉點霉抗病性的 聚類分析

由病害分級標準結(jié)合聚類分析結(jié)果(表2)，得出云南主栽的31個核桃抗病性分級結(jié)果，其中抗性品種16個(占總數(shù)的51.6%)，中抗品種7個(22.6%)，中感品種6個(19.4%)，感病和高感各1個(3.2%)。

表2 不同核桃品種接種胡桃葉點霉后的抗病性反應

3 小結(jié)與討論

核桃抗病育種是一項復雜的工作，品種的抗病性不僅取決于自身的內(nèi)在條件，亦受各種外界條件的影響[19-20]。抗病性評價有利于快速篩選出抗病品種，為育種工作提供理論依據(jù)[21]。室內(nèi)離體接種評價是抗性評價的重要手段之一，而離體葉片接種是操作簡便、快速、有效的病害評價方法。張子君等[22]采用葉片離體接種的方法對不同品種番茄進行早疫病抗性評價；劉莉等[23]采用葉片和枝條離體接種的方法對17個核桃品種進行抗病性評價；余仲東等[24]采用室內(nèi)針刺接種的方法對核桃潰瘍病進行抗病性評價。云南地形條件特殊，地勢復雜，核桃栽培模式多樣化，加之管理缺陷等因素，核桃種植受葉斑病的影響日益嚴重[19]。

我國核桃抗病育種起步較晚，本次研究結(jié)果表明，云南主栽的31個核桃品種對Phyllostictajuglandis的抗病性存在差異。將31個品種的抗病性分為5類，包括16個抗病品種、7個中抗品種、6個中感品種、1個感病品種和1個高感品種，其中，抗病品種占51.6%，中抗占22.6%，中感占19.4%，感病和高感占6.5%。本次試驗通過室內(nèi)離體接種對云南主栽的31個核桃品種進行抗性評價，篩選到抗性品種23個，可為后續(xù)云南核桃園改造和新建提供品種選育參考。