白小梅，李正儀

缺血再灌注損傷在腦梗死發(fā)展過程中占有重要的地位[1]，其病理生理過程較復(fù)雜，是一個(gè)多因素多環(huán)節(jié)相互作用的過程[2]。如何減輕這一損傷一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的重要方面,而髓鞘的受損、修復(fù)、再生情況成為近年來的研究熱點(diǎn)。髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin associated glycoprotein，MAG)及含有亮氨酸重復(fù)序列及免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的Nogo受體作用蛋白-1(leucine-rich repeat sequence and Ig domain-containing,Nogo recepter-interacting protein-1,Lingo-1)是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘相關(guān)的3種蛋白。

丁苯酞(dl-3n-butylphthalide，NBP)是一種廣泛應(yīng)用于缺血性卒中患者的神經(jīng)保護(hù)藥物，可在腦梗死的多個(gè)環(huán)節(jié)起作用[3]，但目前的相關(guān)研究大部分集中于NBP對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)，對(duì)髓鞘的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)采用線栓法阻塞S-D大鼠大腦中動(dòng)脈建立局灶性腦缺血再灌注模型，通過免疫組化染色的方法測定腦組織皮質(zhì)區(qū)MBP、MAG、Lingo-1的動(dòng)態(tài)表達(dá)，探討腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)纖維髓鞘的受損情況及NBP對(duì)受損髓鞘的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和分組 健康、清潔級(jí)S-D雄性大鼠72只，體重范圍在250 g～280 g之間(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。將大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、模型組和藥物組，每組24只。每組按大鼠腦缺血再灌注時(shí)間點(diǎn)不同分為1 d、3 d、5 d、7 d 4個(gè)不同亞組，每個(gè)亞組6只大鼠。

1.2 試劑及藥物 兔抗大鼠MBP、MAG、Lingo-1多克隆抗體及SP-0023免疫組化染色試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色劑試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；丁苯酞原液(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司)溶于0.5%的吐溫80溶液中配成濃度為20 mg/ml的丁苯酞溶液。

1.3 模型制備 本實(shí)驗(yàn)采用線栓法建立大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型。術(shù)前大鼠禁食12 h，10%水合氯醛溶液(0.35 ml/100 g)腹腔麻醉大鼠，消毒后將大鼠頸部正中皮膚切開，分別結(jié)扎頸外動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈，在距離頸總動(dòng)脈分叉處約4 mm的近心端剪一V型切口，將栓線插至頸內(nèi)動(dòng)脈約18～20 mm處，成功建立MCAO模型。常規(guī)消毒縫合切口。2 h后拔除栓線實(shí)現(xiàn)腦缺血再灌注。對(duì)照組只將栓線插至左頸總動(dòng)脈分叉處，其余步驟均與模型組相同。藥物組大鼠建立模型后腹腔注射丁苯酞溶液[20 mg/(kg·次)、2次/d]。對(duì)照組和模型組大鼠腹腔注射生理鹽水[1 ml/(kg·次)、2 次/d]。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分 使用Zea-Longa的5級(jí)4分法對(duì)MCAO模型大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分：無神經(jīng)功能缺損癥狀0分;提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展1分;向病灶對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈2分;向病灶對(duì)側(cè)傾倒3分;無自發(fā)活動(dòng)，意識(shí)水平下降4分。選取評(píng)分為2分和3分的大鼠為模型組、藥物組。

1.5 取材及切片制備 缺血再灌注1 d、3 d、5 d、7 d時(shí)麻醉各組大鼠，分別用0.9%氯化鈉溶液、4%多聚甲醛溶液進(jìn)行心臟灌注、固定并迅速斷頭，將腦組織完整取出后固定48 h至沉底。將左側(cè)大腦以視交叉為中心切取其前后2 mm冠狀切片組織，常規(guī)進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋并制備厚度為5 μm的切片用于免疫組化染色。

1.6 免疫組化染色 使用SP法，依次對(duì)腦組織切片脫蠟、水化，pH 6.0、0.01 mol/L檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加封閉用正常山羊血清工作液，放37 ℃恒溫箱20 min后取出，在各組切片上分別滴加一抗(MBP稀釋比例1∶200、MAG稀釋比例1∶100、Lingo-1稀釋比例1∶100)，4 ℃冰箱過夜，室溫30 min，PBS緩沖液沖洗3次，滴加二抗、PBS緩沖液沖洗后進(jìn)行DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明及封片，光鏡下觀察。使用LEICAQ550CW圖像采集及分析系統(tǒng)在×200倍光鏡下對(duì)MBP、MAG及Lingo-1的免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行圖像采集，并對(duì)其陽性染色程度進(jìn)行灰度值測定。測定灰度值時(shí)，分別取每組每只大鼠的腦組織切片2張，每張切片均在皮質(zhì)區(qū)既定部位隨機(jī)選取3個(gè)視野測定的灰度值，然后求平均數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 MBP 對(duì)照組大鼠皮質(zhì)區(qū)MBP陽性表達(dá)，髓鞘呈棕褐色、魚骨刺樣緊密排列，隨再灌注時(shí)間點(diǎn)推移表達(dá)強(qiáng)度無明顯變化(P>0.05)。模型組、藥物組MBP均在再灌注1 d時(shí)開始減少，3 d時(shí)最少，隨后逐漸增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組、藥物組MBP比同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組減少(P<0.05)。藥物組MBP比模型組5 d、7 d時(shí)增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1、圖1)。

2.2 MAG 對(duì)照組大鼠皮質(zhì)區(qū)MAG陽性表達(dá)，主要為少突膠質(zhì)細(xì)胞及少量皮質(zhì)纖維呈棕黃色，隨再灌注時(shí)間點(diǎn)推移表達(dá)強(qiáng)度無明顯變化(P>0.05)。模型組、藥物組MAG再灌注3 d時(shí)明顯增多，隨后逐漸減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組、藥物組MAG較對(duì)照組1 d時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);3 d、5 d、7 d時(shí)增多(P<0.05)。藥物組MAG比模型組5 d時(shí)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2、圖2)。

2.3 Lingo-1 對(duì)照組皮質(zhì)區(qū)Lingo-1陽性表達(dá)，主要為神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞棕黃色，表達(dá)強(qiáng)度隨再灌注時(shí)間點(diǎn)推移無明顯變化(P>0.05)。模型組、藥物組皮質(zhì)區(qū)Lingo-1再灌注1 d時(shí)明顯增多，隨后逐漸減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組、藥物組皮質(zhì)區(qū)Lingo-1較同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組均增多(P<0.05)。藥物組Lingo-1較模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見表3、圖3)。

表1 各組大鼠皮質(zhì)MBP陽性表達(dá)灰度值比較

與對(duì)照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05

表2 各組大鼠皮質(zhì)MAG陽性表達(dá)灰度值比較

與對(duì)照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05

表3 各組大鼠皮質(zhì)Lingo-1陽性表達(dá)灰度值比較

與對(duì)照組比較*P<0.05

3 討 論

腦缺血再灌注損傷會(huì)引起神經(jīng)的一系列炎性反應(yīng)，破壞腦屏障完整性，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[4]。髓鞘是包裹在有髓神經(jīng)纖維軸突周圍的管狀外膜，由蛋白質(zhì)和鞘磷脂構(gòu)成，具有絕緣和提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度的作用[5]。MBP定位于有髓神經(jīng)的髓鞘漿膜面，是髓鞘中含量最高的蛋白，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性，與少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocytes,OLGs)分化、髓鞘形成關(guān)系密切，對(duì)維持髓鞘穩(wěn)定性起著重要作用，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的標(biāo)志物[6～8]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組較對(duì)照組MBP減少，提示MBP與缺血再灌注損傷相關(guān),再灌注3 d時(shí)表達(dá)最少,則提示此時(shí)髓鞘損傷最嚴(yán)重，這與國內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果基本一致[9～11]。MBP表達(dá)下降原因可能是腦缺血再灌注過程中大量自由基釋放，導(dǎo)致與膜結(jié)構(gòu)相結(jié)合的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降，同時(shí)鈣離子內(nèi)流進(jìn)入髓鞘包繞的軸突，激活鈣依賴性蛋白酶使MBP水解；其次，髓磷脂中的不飽和鍵易被自由基氧化，易使MBP與脂質(zhì)脫失，造成MBP下降；此外大量炎性因子釋放后損傷成熟OLGs，使MBP釋放或漏出至胞外，進(jìn)一步導(dǎo)致MBP表達(dá)減少。也有學(xué)者將MBP作為恢復(fù)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和髓鞘形成的動(dòng)態(tài)觀察指標(biāo)[12]。本實(shí)驗(yàn)中藥物組較模型組的MBP表達(dá)有所增加，但用藥5 d、7 d時(shí)差異才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示丁苯酞對(duì)髓鞘損傷有一定緩解作用，且用藥達(dá)到一定時(shí)長后作用比較明顯。

MAG也是一種髓鞘特異蛋白，與MBP不同的是它定位于髓鞘最里層，與軸突直接接觸，是組成髓鞘的重要成分之一，主要參與髓鞘的形成、調(diào)節(jié)髓鞘與軸突間的作用、維持髓鞘結(jié)構(gòu)的完整性等[13,14]。在神經(jīng)發(fā)育過程、髓鞘形成的早期階段MAG具有促進(jìn)作用，在成熟神經(jīng)系統(tǒng)和髓鞘形成晚期則發(fā)揮著抑制作用[15]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組、藥物組MAG表達(dá)先升高，隨后逐漸降低，這與國內(nèi)學(xué)者觀察到大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中MAG表達(dá)情況相吻合[16]。早期MAG逐漸升高，可能與MAG在腦損傷早期階段應(yīng)激性發(fā)揮抵抗興奮性氨基酸毒性相關(guān)。隨后MAG表達(dá)降低可能是對(duì)缺血缺氧敏感，缺血再灌注后功能受損或凋亡使其數(shù)量下降。但與對(duì)照組相比，此時(shí)模型組MAG的表達(dá)仍然是增多的，可能與殘留的受損髓鞘引發(fā)MAG作為髓鞘相關(guān)抑制因子在腦缺血后發(fā)揮軸突抑制功能相關(guān)。研究[17]顯示MAG通過與髓鞘相關(guān)抑制因子的共同受體NgR相結(jié)合，并在P75NTR的參與下，激活RhoA即小鳥嘌呤核苷三磷酸酶，最終發(fā)揮抑制作用。有學(xué)者認(rèn)為在腦缺血過程中，MAG介導(dǎo)了髓鞘的疏松、解離，致使少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘的損傷早于神經(jīng)元病變[18]。這與本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察到大鼠皮質(zhì)區(qū)MBP表達(dá)降低相吻合。藥物組大鼠MAG的表達(dá)比模型組降低，提示丁苯酞在腦缺血再灌注損傷過程中對(duì)腦皮質(zhì)有保護(hù)作用，可能通過保護(hù)線粒體、改善腦組織能量代謝及局部微循環(huán)等[3]保護(hù)神經(jīng)髓鞘。

Lingo-1是一種跨膜蛋白質(zhì)，選擇性表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的OLGs和神經(jīng)元，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性，主要功能是負(fù)性調(diào)節(jié)OLGs的分化、髓鞘形成、神經(jīng)元存活及軸突再生等過程[19]。成年大鼠Lingo-1的表達(dá)水平在大腦皮質(zhì)最高[20]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組Lingo-1表達(dá)1 d時(shí)顯著升高，隨時(shí)間推移有所下降，再灌注7 d時(shí)仍高于對(duì)照組。Lingo-1表達(dá)升高可能是機(jī)體在腦缺血再灌注后的一種應(yīng)答反應(yīng)，且Lingo-1對(duì)于強(qiáng)化軸突抑制因子的抑制功能有促進(jìn)作用，這也可以解釋MAG作為髓鞘抑制因子之一在本實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)是升高的。藥物組Lingo-1與模型組相比有所降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間較短有關(guān)。研究證明[21]Lingo-1在不依賴LRRs的情況下能抑制髓鞘堿性蛋白MBP的表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察到MBP表達(dá)降低也是相一致的。此外，有學(xué)者[22]曾對(duì)局灶性腦梗死大鼠的Lingo-1表達(dá)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Lingo-1 mRNA及Lingo-1在腦缺血后1 d時(shí)達(dá)到高峰，在21 d時(shí)仍然高于假手術(shù)組。這與本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M1 d時(shí)Lingo-1的表達(dá)明顯增多相吻合，不同的是本實(shí)驗(yàn)未能觀察到7 d以后各組Lingo-1的表達(dá)程度和變化趨勢，還有待于今后進(jìn)一步研究。此外，藥物組較模型組Lingo-1表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異也可能是本實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間較短。為了減輕Lingo-1的髓鞘抑制作用，有學(xué)者[23]使用Lingo-1抗體來拮抗Lingo-1的抑制性作用，發(fā)現(xiàn)Lingo-1拮抗劑可以改善小鼠髓鞘損傷和空間記憶缺陷。另有研究表明抑制Lingo-1可以促進(jìn)脊髓脫髓鞘后的功能恢復(fù)[19]。目前Lingo-1拮抗劑在神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘相關(guān)疾病如多發(fā)性硬化的治療中已有所應(yīng)用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后髓鞘相關(guān)的3種蛋白進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示MBP表達(dá)減少，MAG及Lingo-1表達(dá)增多，提示大鼠腦缺血再灌注過程誘發(fā)髓鞘損傷，丁苯酞對(duì)受損髓鞘有一定保護(hù)作用。但腦缺血再灌注損傷后MBP、MAG和Lingo-1更具體的表達(dá)規(guī)律、相互間的關(guān)聯(lián)、丁苯酞對(duì)受損髓鞘的影響機(jī)制還需今后進(jìn)一步的研究。

圖1 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后術(shù)側(cè)皮質(zhì)區(qū)MBP表達(dá)(SP 法，×200)(a、b、c-再灌注3 d對(duì)照組、模型組、藥物組)

圖2 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后術(shù)側(cè)皮質(zhì)區(qū)MAG表達(dá)(SP 法，×200)(a、b、c-再灌注3 d對(duì)照組、模型組、藥物組)

圖3 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后術(shù)側(cè)皮質(zhì)區(qū)Lingo-1表達(dá)(SP 法，×200)(a、b、c-再灌注1 d對(duì)照組、模型組、藥物組)