劉 維, 英振昊, 張國麗, 劉 偉

由于缺血性腦卒中后的神經(jīng)功能修復(fù)機制尚未明確，導(dǎo)致其機制性研究成為了近年來現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亟待解決的問題之一。皮質(zhì)脊髓束(Corticospinal tract，CST)重塑對其有著一定的促進作用。復(fù)健片對卒中病后受損神經(jīng)功能的修復(fù)有顯著地促進作用[1]，可以促進皮質(zhì)脊髓束重塑[2,3]。腦卒中發(fā)生后，失神經(jīng)支配側(cè)的脊髓灰質(zhì)部位出現(xiàn)CST重塑，且其重塑對癱瘓肢體運動功能的恢復(fù)有一定促進作用[4]，這高度提示了局灶性腦梗死后脊髓可能參與了缺損神經(jīng)功能的修復(fù)。研究表明，Nogo-A與其受體NgR結(jié)合可抑制軸突再生[5～7]，而生長相關(guān)蛋白43(GAP-43)是軸突生長和可塑性的示蹤因子。故本研究采納大腦中動脈閉塞(MACO)模型，分析復(fù)健片干預(yù)下腦梗死后頸髓GAP-43表達(dá)以及Nogo-A-NgR信號通路的表達(dá)變化，以期揭示局灶性腦梗死后CST重塑的可能啟動機制及藥物干預(yù)機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠12周齡，55只，體重維持在250～300 g，實驗大鼠均購自于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，其合格證號為：SCXK(魯)20140007。大鼠實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗室動物管理和使用委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 主要儀器 腦立體定位儀(第二軍醫(yī)大學(xué)，上海)，微量天平(Mono Bloc AB204-S)，臺式恒溫振蕩器(上海躍進醫(yī)療器械THZ-92B),超聲波細(xì)胞粉碎機(西安德派公司),垂直板蛋白電泳儀(上海天能公司),化學(xué)發(fā)光多色熒光成像系統(tǒng)(法國Vilber Fusion FX7),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(美國安捷倫MX3000P實時熒光定量PCR儀),偏光熒光顯微鏡(日本尼康公司)。

1.3 主要試劑 神經(jīng)示蹤劑生物素葡聚糖胺(BDA)試劑盒購于Molecular Probes公司，大鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒購于武漢基因美科技有限公司，lightCyler480 SYBR Green I Master、lightCyler480 Multiwell plate 96試劑盒均購于Roche公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Takara公司，即用型正常山羊血清購于武漢博士德生物工程有限公司，兔抗大鼠GAP-43單抗購于Abcam公司，羊抗兔IgA二抗、Nogo-A抗體、NgR抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，羊抗兔熒光二抗購于Invitrogen公司。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備及分組 按Tamura[8]改良法對造模組制備右側(cè)近端大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。待大鼠麻醉醒后，對大鼠進行測試，其中造模成功的大鼠須符合以下標(biāo)準(zhǔn)(至少符合一項):(1)對大鼠左側(cè)肢體對疼痛刺激無收縮反應(yīng)；(2)大鼠在平面上自由爬行會向患側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒；(3)大鼠被提尾懸掛空中時左上肢屈曲、內(nèi)收。隨機選取45只造模成功的MCAO大鼠作為未BDA組(術(shù)后1 w和術(shù)后2 w組)和BDA組(術(shù)后2 w組)，其中未BDA組包括藥物組和模型組各8只;BDA組包括藥物組和模型組各5只。另隨機選取13只健康大鼠，除不閉塞大腦中動脈，其它操作與造模組相同，其中8只作為未BDA組的假手術(shù)組;5只作為BDA組的假手術(shù)組。

2.2 給藥方法 每組大鼠同時于術(shù)后1 w末進行灌胃，藥物組大鼠給予復(fù)健片濃縮液(由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥劑教研室制作)，按照5.9 ml/kg劑量灌胃，其余大鼠灌胃等量的生理鹽水，一日一次。自由飲水、飲食。復(fù)健片濃縮液生產(chǎn)批號：20161012，其中生藥濃度為1.53 g/ml。

2.3 BWT評分 分別于MCAO術(shù)后1 w末、2 w末，采用Feeney等[9]走橫木試驗(BWT)對各組大鼠進行運動功能評分并記錄(2人同時觀測，其中1人不知分組情況)。

2.4 BDA(biotin dextran amine BDA)順行示蹤 術(shù)后1 w末對BDA組的3組大鼠的左側(cè)大腦皮質(zhì)注射生物素葡聚糖胺(Biotin dextran amine，BDA)。將大鼠以4%水合氯醛(0.7 ml/100 g體重)進行腹腔注射麻醉，待麻醉成功后用剃毛器對頭頂部皮膚備皮，將大鼠固定在腦立體定位儀上，切開頭皮，剝離骨膜，充分暴露前囟及左側(cè)感覺運動區(qū)。注射點為：以前囟為標(biāo)準(zhǔn)，分別于前囟中點后1 mm、2 mm;左側(cè)旁開3.5 mm、4.5 mm處，即(-1 mm，3.5 mm)、(-1 mm,4.5 mm)、(-2 mm，3.5 mm)、(-2 mm，4.5 mm)4個部位注射BDA。用微型電鉆鉆孔至硬腦膜，10 μl微量注射器注射，每個注射點注入0.2 μl 10%BDA溶液，注射深度為皮質(zhì)下1.5 mm～1.7 mm。注射結(jié)束后，將針頭停留2 min，拔出針頭，將腦表面用薄層明膠海綿覆蓋，進行頭皮縫合。

2.5 取材及指標(biāo)檢測 將各組大鼠在相應(yīng)時間點麻醉處死，并取出大腦和頸髓(C4-C6)，頸髓長度約1.5 cm。其中用于TTC染色的大腦置于-20 ℃冰箱，備用；用于BDA染色顯影的頸髓組織置于4%多聚甲醛固定，備用；用于Western blot、免疫熒光、PT-PCR法檢測的頸髓組織置于液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱，備用。

2.5.1 免疫組織化學(xué)方法觀測頸髓BDA染色顯影 BDA注射1 w后將大鼠麻醉處死，取出頸髓組織 C4-C6節(jié)段，并放于4%多聚甲醛中，過夜固定，然后放于10%、20%、30%蔗糖中剃度脫水。待組織塊沉入容器底后，取出，OCT包埋，用冰凍切片機對包埋后的頸髓組織作連續(xù)冠狀切片，每片厚約40 μm。組織切片先在0.5%H2O2中反應(yīng)15 min；TBS漂洗3次，每次5 min；將切片于含0.3%Trition X-100的TBS(pH7.5)中，4 ℃孵育6 h；TBS漂洗3次，每次5 min；將切片于辣根-HRP(濃度為0.8 μg/ml)中，常溫過夜。TBS漂洗3次，每次5 min；將切片于DAB溶液中(濃度為0.05%，內(nèi)含0.5 mol/ml pH7.6 Tris-HCl，0.1%H2O2)顯色15 min；TBS終止反應(yīng)。裱片，風(fēng)干；75%乙醇中脫水2 min，95%、95%、100%、100%乙醇中各脫水5 min，二甲苯1、二甲苯2中各脫水5 min；脫水完畢后用中性樹膠封片，于普通光鏡下觀察BDA陽性的皮質(zhì)脊髓束的走行分布，并采集圖像。

2.5.2 熒光定量PCR檢測大鼠左側(cè)頸髓(C4-C6)GAP-43 mRNA表達(dá) 將頸髓組織取出后立即置于液氮中研磨，采用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific,Inc.)抽提RNA，并按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄操作。將每組的cDNA取出一部分，等比例混勻，稀釋，此即為熒光定量PCR的模板。其他步驟按照Roche公司SYBR Green試劑盒說明書操作。

2.5.3 Western blot檢測大鼠頸髓(C4-C6)GAP-43蛋白表達(dá) 取出頸髓，對組織進行研磨，并加入裂解液，對研磨后的組織勻漿進行超聲粉碎20 min，離心，取上清液，進行蛋白濃度測定；灌膠；進行蛋白上樣，并加入預(yù)染的蛋白Marker，進行10% SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用5%脫脂奶粉封閉1 h，室溫；加入一抗(GAP-43按1∶20000稀釋)，室溫環(huán)境中孵育2 h，置于4 ℃冰箱，孵育，過夜；復(fù)溫1 h，條帶用TBST漂洗4次，每次8 min；加入二抗(羊抗兔IgG，1∶3000稀釋)，室溫，孵育1 h；TBST漂洗4次，每次8 min；TBS漂洗兩次，每次5 min。DAB顯色反應(yīng)后，使用FUsion軟件拍照，并用Bio1D分析每個條帶的灰度值，以樣本灰度值/β-actin灰度值得到的比值作為最終結(jié)果。

2.5.4 免疫熒光法檢測大鼠頸髓水平Nogo-A、NgR蛋白表達(dá)變化 將各組頸髓組織取出并包埋，冰凍切片，每片厚6 μm；將切片置于丙酮中浸泡15 min；0.01 mmol/L PBS漂洗3次，每次5 min，切片置于濕盒；滴加10%山羊血清(即用型山羊血清，0.01 mmol/L PBS配制)溶液室溫孵育1 h；將多余的封閉液甩掉，將切片置于濕盒，滴加含0.01 mmol/L PBS的一抗-兔單克隆抗體至Nogo-A(1∶200)；兔單克隆抗體至NgR(1∶200);置于4 ℃冰箱孵育過夜，陰性對照采用0.01 mmol/L PBS代替一抗；次日將濕盒于室溫下復(fù)溫30 min;0.01 mmol/L PBS漂洗3次，每次5 min，切片置于濕盒；滴加Alexa 594偶聯(lián)驢抗小鼠IgG(H+L)抗體(1∶400，由抗體稀釋液稀釋)，室溫避光孵育2 h；0.01 mmol/L PBS漂洗3次，每次5 min，切片置于濕盒；滴加DAPI溶液(1∶1000，雙蒸水稀釋)室溫孵育20 min；0.01 mmol/L PBS漂洗3次，每次5 min，切片置于濕盒；滴加少量50%甘油蓋玻片封片；熒光顯微鏡觀察，并拍照。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠不同時間點BWT評分 術(shù)后1 w、2 w末，較之假手術(shù)組，模型組和藥物組評分均低(P<0.05)；且藥物組于術(shù)后2 w末表達(dá)高于模型組(P<0.05)(見表1)。

3.2 梗死對側(cè)及梗死側(cè)頸髓CST神經(jīng)纖維數(shù) 在梗死對側(cè)的頸髓后索可見排列整齊的致密的梭形纖維束，梗死側(cè)頸髓后索可見少量的條索狀的BDA陽性纖維(見圖1)。各組大鼠術(shù)后2 w末梗死對側(cè)頸髓BDA陽性CST纖維總計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但梗死側(cè)頸髓后索中模型組和藥物組BDA陽性纖維總數(shù)明顯多于假手術(shù)組(P<0.05)(見表2)。

3.3 各組大鼠術(shù)后1 w、2 w末頸髓GAP-43 mRNA及蛋白表達(dá) 術(shù)后1 w末，模型組與假手術(shù)組頸髓GAP-43蛋白、mRNA表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；術(shù)后2 w末，藥物組和模型組大鼠頸髓水平 GAP-43蛋白和mRNA表達(dá)較之假術(shù)組均有明顯提升(P<0.05)(見圖2、圖3)。

3.4 各組大鼠術(shù)后1 w、2 w末頸髓Nogo-A、NgR蛋白表達(dá) 術(shù)后2 w末模型組和藥物組大鼠梗死側(cè)頸髓水平的Nogo-A、NgR陽性蛋白數(shù)量均比同期的假手術(shù)組表達(dá)減少，其中藥物組表達(dá)低于模型組(見圖4)。

表1 各組大鼠BWT評分情況

與同期假手術(shù)相比▲P>0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義，*P﹤0.05;與同期模型組相比★P﹤0.05

表2 梗死對側(cè)及梗死側(cè)皮質(zhì)脊髓束BDA陽性纖維總數(shù)

與同期假手術(shù)組比較*P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義,#P<0.05；與模型組比較△P<0.05

圖1 頸髓平面后索區(qū)域BDA 陽性CST纖維(200倍鏡)。箭頭所示為由梗死對側(cè)CST跨越至梗死側(cè)脊髓后索的BDA陽性纖維(A:術(shù)后2 w假手術(shù)組；B:術(shù)后2 w模型組；C：術(shù)后2 w藥物組)

圖2 各組大鼠術(shù)后1、2 w末頸髓(C4-C6)GAP-43 mRNA表達(dá)。與同期的假手術(shù)組相比較*P>0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義,#P<0.05；與同期的模型組相比較▲P>0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義(1 w:術(shù)后1 w末;2 w:術(shù)后2 w末)

圖3 各組大鼠術(shù)后1 w、2 w末頸髓(C4-C6)GAP-43蛋白灰度比值。與同期的假手術(shù)組相比較*P>0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義,#P<0.05；與同期的模型組相比較▲P>0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義(1 w:術(shù)后1 w末;2 w:術(shù)后2 w末。S：假手術(shù)組;M：模型組;A：藥物組)

圖4 術(shù)后2 w末大鼠左側(cè)頸髓Nogo-A、NgR蛋白表達(dá)。Alexa Fluor488標(biāo)記的NgR蛋白呈綠色熒光,DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光×200(S1:術(shù)后1 w假手術(shù)組;M1:術(shù)后1 w模型組;S2:術(shù)后2 w假手術(shù)組;M2:術(shù)后2 w模型組;A2：術(shù)后2 w藥物組)

4 討 論

4.1 西醫(yī)對缺血性卒中及CST重塑的認(rèn)識 缺血性卒中，又稱腦梗死，該病是臨床常見的缺血性腦血管病，常見于老年人[10]。目前，絕大多數(shù)卒中患者沒有有效的治療方法，部分原因是大腦修復(fù)和神經(jīng)元可塑性的機制以及它們與行為和功能恢復(fù)的關(guān)系還不完全清楚。研究表明CST重塑能促進偏癱肢體的運動功能恢復(fù)[11]。腦卒中發(fā)生后，發(fā)生在脊髓失神經(jīng)側(cè)的CST重塑可促進缺損運動功能的恢復(fù)[12]。這提示，局灶性腦梗死后脊髓可能參與了神經(jīng)功能修復(fù)。

BDA是一種神經(jīng)纖維示蹤劑，可以良好地評價CST的微觀結(jié)構(gòu)。通過BDA神經(jīng)順行示蹤技術(shù)，并經(jīng)過BDA染色顯影后，可觀察到約99%的CST在錐體交叉后走行于對側(cè)的脊髓白質(zhì)后索[13]。故本研究使用BDA順行追蹤健側(cè)CST，發(fā)現(xiàn)各組大鼠健側(cè)頸髓后索均可見致密的梭形纖維束，其CST纖維總計數(shù)于各組大鼠之間并無差異，說明各組大鼠未發(fā)生變異，在此前提下，比較梗死側(cè)頸髓BDA陽性CST纖維總計數(shù)更具有科學(xué)性。正常情況下，少數(shù)的頸髓CST會交叉至對側(cè)進行雙側(cè)支配，本研究亦發(fā)現(xiàn)，術(shù)后2 w末，假手術(shù)組大鼠的梗死側(cè)頸髓后索中，可見少量的條索狀的BDA陽性CST纖維。而模型組和藥物組大鼠梗死側(cè)頸髓后索中BDA陽性CST纖維總數(shù)明顯多于假手術(shù)組。而前面已述及各組大鼠梗死對側(cè)的CST纖維總數(shù)并未發(fā)生明顯變化，故模型組、藥物組大鼠梗死側(cè)明顯增多的CST陽性纖維，極可能是腦梗死后對側(cè)CST纖維芽生并跨越至梗死側(cè)的新生纖維。

GAP-43是一種神經(jīng)特異性的軸突膜蛋白，參與神經(jīng)細(xì)胞外生長及軸突發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞再生，主要表達(dá)于軸突的生長錐末端。在神經(jīng)元的發(fā)育及再生過程中，GAP-43可伴隨著軸突的生長大量合成，可作為軸突生長的示蹤因子。成熟哺乳動物中，GAP-43的表達(dá)往往較低，其表達(dá)的升高則意味著軸突的再生長。本實驗結(jié)果表明，術(shù)后2 w末，藥物組和模型組大鼠梗死側(cè)頸髓GAP-43蛋白表達(dá)較之假手術(shù)組均有明顯提升，這一結(jié)果與BDA染色顯影結(jié)果相吻合，這表明，腦梗死后，健側(cè)CST可發(fā)生側(cè)支發(fā)芽，并跨越中線至對側(cè)。但我們發(fā)現(xiàn)術(shù)后1 w末，模型組與假手術(shù)組梗死側(cè)頸髓GAP-43蛋白表達(dá)并無明顯差異，這說明術(shù)后1 w末梗死側(cè)頸髓水平CST重塑可能尚未出現(xiàn)，這高度提示局灶性腦梗死發(fā)生后，健側(cè)大腦皮質(zhì)發(fā)出的CST中線跨越啟動時間可能發(fā)生在術(shù)后1 w末至術(shù)后2 w末之間，故觀測術(shù)后1 w末、2 w末頸髓層面重要神經(jīng)生長相關(guān)因子的表達(dá)，可有助于揭示皮質(zhì)脊髓束重塑的啟動機制。

Nogo-A是一種髓磷脂蛋白，腦梗死后少突膠質(zhì)細(xì)胞過度分泌的Nogo-A是抑制軸突生長的主要因素[14]。Lindau等[15]研究證實，缺血性腦梗死后，Nogo-A蛋白可抑制CST結(jié)構(gòu)及功能的恢復(fù)，但通過抗Nogo-A治療后，跨越中線交叉至去神經(jīng)脊髓半側(cè)的纖維增加至之前的2～3倍，有效地促進了神經(jīng)功能的恢復(fù)。

NgR是Nogo-A的受體，一種位于神經(jīng)元表面的糖基醇磷脂結(jié)合蛋白。研究證實NgR的拮抗劑亦有助于軸突再生[16]。有研究證實，使用NgR1的拮抗劑治療后，可通過抑制缺血腦中的細(xì)胞凋亡，減少大腦梗死面積，來保護大腦免缺血/再灌注損傷，從而改善缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)缺損情況[17,18]。另有研究表明，Nogo-A與其受體NGR結(jié)合后，通過其功能部件激活胞內(nèi)下游靶基因，抑制軸突再生[19～21]。這些研究結(jié)果均說明Nogo-A與其受體NgR不論作為獨立因子發(fā)生作用還是結(jié)合后共同作用，均可對軸突的生長產(chǎn)生一定的抑制作用。

4.2 中醫(yī)對缺血性卒中的認(rèn)識 缺血性卒中大多數(shù)屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，中醫(yī)認(rèn)為其病位在腦，精虧髓空是中風(fēng)病的病機基礎(chǔ)?！爸T髓者，皆屬于腦”，腦髓的充盈與否決定了機體感覺運動功能是否正常?！澳I藏精，精生髓”，故腎中精氣充盈，腦髓得以充養(yǎng)；腎精虧虛，不能上承于腦，腦髓無以充養(yǎng)，大腦調(diào)控機體運動功能失常，可發(fā)為中風(fēng)。因此，臨床對卒中病后期恢復(fù)的治療應(yīng)重視益精填髓法的運用。

本研究選用的復(fù)健片即為益精填髓之方藥，由制何首烏、桑寄生、淫羊藿、海馬、草決明組成。方中何首烏善補肝腎、益精血，填真陰，為君藥；淫羊藿性溫潤，溫補腎陽的同時又無傷髓耗髓之弊，與制何首烏同用以達(dá)陰陽雙補之功；桑寄生補肝腎、益精氣，同時又可豁痰熄風(fēng)，平降氣血；草決明益腎水、清肝導(dǎo)滯。此外，方中海馬，乃為血肉有情之品，溫陽補腎，調(diào)氣活血，以達(dá)陽中求陰之功。由此可見，由諸多填髓中藥組成的復(fù)健片可綜合調(diào)理髓的功能，促進卒中病的后期恢復(fù)。研究表明，復(fù)健片對中風(fēng)病后受損神經(jīng)功能的修復(fù)有著顯著地促進作用[1]，可以促進皮質(zhì)脊髓束重塑[2,3]。而且，復(fù)健片對未損傷側(cè)大腦的下調(diào)腦區(qū)有一定的激活作用[22]，還可以上調(diào)未損傷側(cè)大腦GAP-43的表達(dá)[23]。

4.3 結(jié)果與結(jié)論 本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1 w、2 w末，模型組梗死側(cè)頸髓的Nogo-A和NgR表達(dá)低于同期的假手術(shù)組，其中藥物組低于同期模型組。而前面已證實，術(shù)后2 w末模型組和藥物組梗死側(cè)頸髓水平GAP-43蛋白的表達(dá)較同期假手術(shù)組顯著增強，其運動功能評分亦均高于假手術(shù)組。再者，我們的前期研究已證實，術(shù)后1 w、2 w末，模型組和藥物組大鼠梗死側(cè)頸髓層面的cAMP、PKA-C表達(dá)均高于同期的假手術(shù)組，且藥物組表達(dá)高于同期模型組[1]。故結(jié)合本文的相關(guān)研究結(jié)果，提示局灶性腦梗死后，支配前肢運動的頸髓由于失神經(jīng)支配而短時間激活cAMP-PKA通路，抑制Nogo-A-NgR信號通路的傳導(dǎo)，從而有助于健側(cè)大腦皮質(zhì)發(fā)出的皮質(zhì)脊髓束重新跨越中線，自發(fā)性地完成一定程度的皮質(zhì)脊髓束重塑；而復(fù)健片可以進一步上調(diào)腦梗死后頸髓水平cAMP、PKA-C含量，抑制Nogo-A、NgR表達(dá)，最大程度地實現(xiàn)功能性的CST重塑，從而促進缺損神經(jīng)功能的恢復(fù)，這可能是腦梗死后CST重塑的啟動機制及復(fù)健片干預(yù)機制。

本研究突破了以腦為核心的腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)機制的研究思路，從形態(tài)學(xué)、分子學(xué)和行為學(xué)上動態(tài)觀測了復(fù)健片干預(yù)下局灶性腦梗死后頸髓層面神經(jīng)纖維重塑狀態(tài)變化，為系統(tǒng)地揭示局灶性腦梗死的神經(jīng)修復(fù)機制研究提供了堅實的實驗基礎(chǔ)。但本研究亦存在不足之處：(1)樣本量過少;(2)本研究中涉及的各個因子之間是如何相互影響的，其中間的共同因子尚未涉及，完整的神經(jīng)通路有待深入研究。