陳家輝，任學(xué)義，李麗敏，盧詩意，程湉，譚量天，梁少東，何丹林，羅慶斌，聶慶華，張細權(quán)，羅文

研究報告

轉(zhuǎn)錄組測序揭示細胞周期通路參與雞腹脂沉積

陳家輝，任學(xué)義，李麗敏，盧詩意，程湉，譚量天，梁少東，何丹林，羅慶斌，聶慶華，張細權(quán)，羅文

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雞遺傳育種與繁殖重點實驗室，廣州 510642

近年來，隨著生長性狀和飼料轉(zhuǎn)化率的提高，中國地方品種肉雞腹脂率不斷增加，大大降低了肉雞的品質(zhì)。過多的腹脂沉積不僅降低了肉雞的屠宰率和抗病力，而且由于脂肪較難處理，導(dǎo)致其被隨意丟棄，污染環(huán)境。為了挖掘與中國地方品種肉雞腹脂沉積相關(guān)的基因和調(diào)控通路，本研究對杏花雞分別進行高脂和普通飼料的喂養(yǎng)，檢測腹脂沉積情況，并利用轉(zhuǎn)錄組測序檢測高脂飼養(yǎng)對肝臟和腹脂組織中基因表達的影響。結(jié)果表明，喂養(yǎng)兩周后高脂組肉雞腹脂重和腹脂率顯著增加，且腹脂細胞的直徑和面積也顯著增大。對兩組雞的腹脂和肝臟進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)在腹脂中顯著差異表達基因主要富集于細胞周期通路、PPAR (peroxisome proliferator- activated receptor)信號通路和ECM (extracellular matrix)受體信號通路中；而在肝臟中，顯著差異表達基因同樣顯著富集于細胞周期通路中，同時也顯著富集于類固醇生物合成和PPAR信號通路中。通過分析腹脂和肝臟組織中共同差異表達的基因，發(fā)現(xiàn)這些基因同樣顯著富集于細胞周期中。進一步以雞肝癌細胞系LMH (chicken hepatoma cell)細胞和雞前脂肪細胞系ICP (immortalized chicken preadipocytes)細胞進行體外驗證，利用高脂培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)48 h后，高脂培養(yǎng)基可顯著促進細胞周期進程，增加處于S期的細胞數(shù)。同時，qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂培養(yǎng)基可顯著促進細胞周期相關(guān)基因的表達。綜上所述，本研究通過基因表達差異分析，發(fā)現(xiàn)高脂飼養(yǎng)可能通過激活雞脂肪組織的細胞周期來促進前脂肪細胞增殖，進而增加腹脂沉積。該研究結(jié)果為進一步了解優(yōu)質(zhì)肉雞腹脂沉積的機制提供了理論依據(jù)。

杏花雞；高脂飼料；腹脂沉積；細胞周期；差異表達基因

隨著育種、營養(yǎng)、免疫和環(huán)境管理等對雞生長狀態(tài)的不斷改進，現(xiàn)代肉雞表現(xiàn)出良好的生長性能，但在體重增加的情況下，肉雞體內(nèi)的脂肪沉積也不斷增多，尤其是肉雞腹脂沉積過高過快的問題逐漸顯現(xiàn)出較大的弊端。適當(dāng)?shù)闹境练e可提高肉質(zhì)，增加肌肉風(fēng)味，但過多的脂肪沉積不僅降低了雞的屠宰率和飼料轉(zhuǎn)化率，還會影響雞的繁殖性能和抗病能力[1,2]。另一方面，由于脂肪的加工較為復(fù)雜，目前主要以廢棄物的形式將其處理，由此不僅減少了生產(chǎn)者的經(jīng)濟利益，還增加了對環(huán)境的危害，不利于肉雞業(yè)的長足發(fā)展[3]。

與國外普遍食用快大型肉雞不同，國內(nèi)更偏向于食用本地的土雞品種，特別是傳統(tǒng)的中國烹飪法更是對肉雞的品種和品質(zhì)有嚴格的要求。相比于快大型肉雞，土雞品種雖然長肉少、長肉慢，但卻普遍擁有更好的肉質(zhì)，也更適合中國人的烹飪方式。但近些年隨著規(guī)?；图s化養(yǎng)殖的普及，土雞品種腹脂沉積越來越多，成為影響土雞品質(zhì)的一大因素[4]。如何減少土雞或肉雞的腹脂沉積，已成為育種和養(yǎng)殖技術(shù)人員的重要研究課題。目前對于肉雞腹脂率的選種方法包括體尺測量間接選擇法、飼料轉(zhuǎn)化率間接選擇法、活體觸摸評分法、同胞屠宰法、VLDL(very low density lipoprotein)濃度法和分子標記輔助選擇法[5]。因為腹脂性狀具有中高等的遺傳力[5]，所以這些方法都能在一定程度上降低肉雞的腹脂沉積。但對于肉雞腹脂沉積的遺傳機制，包括相關(guān)的主效基因、QTL和調(diào)控通路等，目前仍然存在許多亟待解決的問題[6]。

飼料中添加高含量的脂肪能促進肉雞生長，同時也能增加肉雞腹脂沉積[7]。對小鼠()進行高脂飼養(yǎng)可誘導(dǎo)脂肪生成相關(guān)基因的表達，激活脂質(zhì)代謝相關(guān)通路，最終提高體脂沉積[8]。因此，通過在飼料中添加更高比例的含脂物質(zhì)，可誘導(dǎo)肉雞體內(nèi)脂肪沉積相關(guān)基因的表達，從而增加腹脂沉積。但腹脂沉積不僅僅與脂肪生成和脂質(zhì)代謝相關(guān)，還涉及許多與細胞功能和活動相關(guān)的進程。本研究以廣東4大名雞之一的杏花雞為實驗材料，通過喂養(yǎng)高脂飼料和普通飼料，檢測其腹脂沉積情況，并對與脂質(zhì)代謝緊密相關(guān)的肝臟和腹脂進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析飼料中不同脂肪含量的飼養(yǎng)模式對這兩種組織中基因表達的影響，由此挖掘與脂肪沉積相關(guān)的基因、通路和細胞進程，為進一步了解肉雞腹脂沉積的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 肉雞飼養(yǎng)及細胞來源

從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)科研禽場獲得體重相近的8周齡純種杏花雞母雞，隨機分組，每組6只母雞，分別飼喂高脂飼料(飼料中含有40%碳水化合物、25%脂肪和20%蛋白質(zhì))和普通飼料(飼料中含有41%碳水化合物、5%脂肪和22%蛋白質(zhì))整兩周。實驗所用雞肝癌細胞系LMH (chicken hepatoma cell)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈，雞前脂肪細胞系ICP (immortalized chicken preadipocytes)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室饋贈。

1.2 肉雞屠宰測定

用高脂飼料和普通飼料分開飼養(yǎng)整2周后，測量雞活體重，進行屠宰并檢查其胴體品質(zhì)。脫毛后取出內(nèi)臟，測量半凈膛重；取出腹部脂肪，稱量腹脂重；取肝、腹脂組織樣本液氮速凍，隨后保存于?80℃冰箱用于提取RNA等；取腹脂組織樣本保存于10%福爾馬林中用于切片。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序

提取–80℃冰凍保存的肝臟和腹部脂肪樣品總RNA，利用深圳華大基因公司BGI-500測序平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)的初步分析。所有序列數(shù)據(jù)均已保存在NCBI'S Gene Expression Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nim.nih.gov/geo)中，可通過GEO系列登錄號GSE128340獲取。本研究將組間差異倍數(shù)≥2、Q值(矯正后的值)≤0.001的基因作為顯著差異表達基因。為了驗證高通量測序結(jié)果的準確性，本研究隨機選取7個與細胞周期通路相關(guān)的差異表達基因(如、、、、、和)進行qRT-PCR驗證。

1.4 RNA提取、cDNA合成和qRT-PCR

利用RNaiso試劑(TaKaRa公司，日本)分別對雞的肝臟組織、腹脂組織、LMH和ICP細胞進行總RNA提取。根據(jù)試劑盒操作說明書，以總RNA為模板，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa公司，日本)進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA為模板，使用ITAQTMUniversal SYBR? Green Supermix (Bio-Rad公司，美國)對選取的差異表達基因進行qRT-PCR檢測。擴增所用的引物信息見表1。擴增體系：10 μL 2×SYBR?Green Supermix、0.5 μL正向引物(10 μmol/L)、0.5 μL反向引物(10 μmol/L)、2 μL cDNA、7 μL MilliQ 水。擴增條件：95℃ 1 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。所有反應(yīng)均設(shè)3個重復(fù)。qRT-PCR擴增數(shù)據(jù)分析采用2–ΔΔCT法分析基因表達情況[9]。對LMH細胞進行qRT-PCR擴增所用的內(nèi)參基因為[10]，引物序列用Primer premier 5軟件設(shè)計；對ICP細胞進行qRT-PCR擴增所用的內(nèi)參基因為，引物序列參考文獻[11]。

1.5 石蠟切片

對上述10%福爾馬林溶液保存的腹脂樣品進行石蠟切片，比較高脂雞和正常雞的腹脂細胞大小。樣品經(jīng)乙醇脫水和二甲苯透明后，經(jīng)過浸蠟使溶解的石蠟滲透進樣品中。夾取已浸蠟組織塊埋入熔蠟中并編號。待包埋模具內(nèi)的熔蠟表面凝固后，放入冷水中加速凝固。凝固后切成規(guī)則的正方形或長方形備用。每個樣品固定后經(jīng)粗切、細切切出較為完好的切片后，放到溫水中展平然后用玻片撈起，烘箱過夜即可。

表1 qRT-PCR擴增引物

1.6 HE染色

制作好的切片經(jīng)55℃烘箱烘烤固定6~12 h，使用蘇木素–伊紅染色試劑盒(上海碧云天生物公司)進行染色。經(jīng)蘇木素染色、沖洗、返藍、伊紅染色、透明等步驟后，顯微鏡觀察染色情況，選擇染色較清晰的切片進行樹膠封片。封片后擇日拍照。

1.7 細胞培養(yǎng)與高脂處理

普通培養(yǎng)基為含10%或15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，高脂培養(yǎng)基參考文獻[12]配制，即在普通培養(yǎng)基中加入0.66 mmol/L油酸鈉、0.33 mmol/L軟脂酸鈉和1 mmol/L牛血清白蛋白。

雞前脂肪細胞系ICP細胞的培養(yǎng)：利用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天觀察細胞形態(tài)，及時換液。雞肝癌細胞系LMH細胞培養(yǎng)：利用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天觀察細胞形態(tài)，及時換液。

高脂處理：在加入高脂培養(yǎng)基的前一天，用胰酶消化已長滿的細胞并進行計數(shù)，按照一定密度鋪于24孔細胞培養(yǎng)板和12孔細胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細胞在多孔板中長至約80%密度時，將普通培養(yǎng)基更換為高脂培養(yǎng)基，再持續(xù)培養(yǎng)48 h，隨后收集細胞，進行細胞周期檢測(12孔板)和RNA抽提(24孔板)。

1.8 細胞周期分析

在細胞高脂處理48 h后，用75%乙醇收集細胞，在?20℃下過夜固定。乙醇固定后，用含10 μg/mL RNA酶A(TaKaRa公司，日本)和含0.2%(v/v)Triton X-100(Sigma公司，美國)的50 μg/mL碘化丙啶(Sigma公司，美國)在4℃下染色30 min。隨后使用BD Accuri C6流式細胞儀(BD Biosciences公司，美國)分析細胞周期，并使用Flowjo 7.6軟件(Verity Software House)進行數(shù)據(jù)分析。

同時，選取9個基因(、、、、、、、和)，利用qRT-PCR進行細胞周期的檢測。這9個基因既屬于細胞周期通路，又同時在肝臟和腹脂中顯著差異表達。

1.9 脂肪細胞大小的測量

用福爾馬林保存好的腹脂制作石蠟切片，在Nikon Eclipec-Ti顯微鏡觀察下，利用NIS-Elements BR軟件測量脂肪細胞的大小和平均直徑。每只雞進行3次切片，每個切片隨機選取至少3個視野，進行脂肪細胞大小和直徑的測量，每個視野至少選取20個細胞，記錄后將結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

利用在線DAVID軟件(http://david.abcc.ncifcrf. gov/home.jsp)進行顯著差異表達基因的GO功能注釋和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)富集通路分析；互作通路分析采用在線Metascape軟件(http://metascape.org/gp/index.html#/ main/step1)進行。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤的形式表示，肉雞樣本每組6個重復(fù)，細胞樣本每組3個重復(fù)。數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件中的獨立樣本檢驗進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂日糧可增加肉雞腹脂沉積，增大腹脂細胞直徑和面積

為了解參與肉雞腹脂沉積的基因、信號通路和細胞進程，本研究構(gòu)建了肉雞高脂組(高脂日糧飼喂)和普飼組(普通日糧飼喂)兩個模型。在連續(xù)兩周飼喂特定飼料后，對10周齡肉雞稱重后進行屠宰測定。相比于普飼組，高脂組雞的活重?zé)o明顯差異(圖1A)。雞腹部脂肪重和腹脂率高脂組和普飼組差異顯著(圖1，B和C)，高脂組雞的腹脂重和腹脂率顯著高于普飼組(<0.05)。對雞腹脂進行石蠟切片觀察，發(fā)現(xiàn)高脂組的杏花雞腹部脂肪單個細胞明顯大于普飼組的腹部脂肪單個細胞(圖1D)。利用NIS-Elements BR軟件測量脂肪細胞的大小和平均直徑，通過對比兩組雞脂肪細胞的面積和直徑，進一步證實高脂組肉雞腹脂細胞顯著大于普飼組(圖1E)。以上結(jié)果表明，高脂喂養(yǎng)可增加肉雞腹脂沉積，增大腹部脂肪細胞直徑和面積。

2.2 高脂雞和普飼雞中腹脂組織的基因表達差異分析

為了鑒定參與肉雞腹脂沉積的基因，本研究將高脂和普通飼料喂養(yǎng)兩周的肉雞屠宰后，采集肝臟和腹脂進行轉(zhuǎn)錄組測序。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂組相比于普飼組，有273個基因的表達顯著上調(diào)，491個基因的表達顯著下調(diào)，另外17 568個基因表達差異不顯著(圖2A)。對所有顯著差異表達的基因進行GO功能注釋，發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集于細胞周期、細胞分裂、染色質(zhì)分離等與細胞增殖相關(guān)的生物學(xué)進程(圖2B)。對這些顯著差異表達基因進行KEGG通路富集分析，也發(fā)現(xiàn)它們可顯著富集于細胞周期通路中，除此之外還能富集于蛋白質(zhì)消化吸收、p53信號通路和過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)信號通路等(圖2C)。本研究利用Metascape構(gòu)建了這些顯著差異表達基因的互作網(wǎng)絡(luò)(圖2D)。從網(wǎng)絡(luò)中可以發(fā)現(xiàn)，所有與細胞周期通路相關(guān)的基因都表現(xiàn)出在高脂肉雞腹脂中顯著上調(diào)的現(xiàn)象，暗示高脂喂養(yǎng)可能激活了腹部脂肪組織中前脂肪細胞的增殖。

圖1 高脂喂養(yǎng)對肉雞腹脂沉積的影響

A：高脂組和普飼組肉雞飼喂特定飼料2周后的屠宰前體重；B：高脂組和普飼組肉雞腹脂重；C：高脂組和普飼組肉雞腹脂率；D：高脂組和普飼組肉雞腹脂細胞的切片觀察；E：高脂組和普飼組肉雞腹脂細胞的面積和直徑統(tǒng)計分析。*<0.05，***<0.001。

圖2 高脂雞和普飼雞中腹脂組織的基因表達差異分析

A：Scatter plot分析高脂雞和普飼雞腹脂組織中的差異表達基因(HN_fat代表高脂雞的腹脂，NN_fat代表普飼雞的腹脂)；B：顯著差異表達基因的GO功能注釋；C：顯著差異表達基因的KEGG通路分析；D：顯著差異表達基因的互作網(wǎng)絡(luò)(淺藍色代表細胞周期通路相關(guān)基因)。

2.3 高脂雞和普飼雞中肝臟組織的基因表達差異分析

肝臟是脂質(zhì)代謝的核心器官，因此，除了對腹脂進行轉(zhuǎn)錄組測序分析之外，本研究對高脂雞和普飼雞的肝臟也進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂組相比于普飼組，有502個基因的表達顯著上調(diào)，569個基因的表達顯著下調(diào)，另外17 261個基因表達差異不顯著(圖3A)。對所有顯著差異表達的基因進行GO功能注釋，發(fā)現(xiàn)這些基因可顯著富集于類固醇相關(guān)的生物合成和代謝進程中(圖3B)。對這些顯著差異表達基因進行的KEGG通路富集分析也發(fā)現(xiàn)，它們可顯著富集于類固醇生物合成和代謝通路進程中(圖3C)。除此之外，肝臟中的差異表達基因與腹脂中類似，可同樣富集于細胞周期通路和PPAR信號通路中。利用Metascape構(gòu)建了這些顯著差異表達基因的互作網(wǎng)絡(luò)(圖3D)。從網(wǎng)絡(luò)中也發(fā)現(xiàn)所有與細胞周期通路相關(guān)的基因(淺藍色)都表現(xiàn)出在高脂肉雞中顯著上調(diào)表達的現(xiàn)象，暗示高脂喂養(yǎng)可能激活了肝臟組織相關(guān)細胞的增殖。

圖3 高脂雞和普飼雞中肝臟組織的基因表達差異分析

A：Scatter plot分析高脂雞和普飼雞肝臟組織中的差異表達基因(HN_liver代表高脂雞的肝臟，NN_liver代表普飼雞的肝臟)；B：顯著差異表達基因的GO功能注釋；C：顯著差異表達基因的KEGG通路分析；D：顯著差異表達基因的互作網(wǎng)絡(luò)(淺藍色代表細胞周期通路相關(guān)基因)。

2.4 腹脂和肝臟中的共同差異表達基因顯著富集于細胞周期通路

本研究對高脂組和普飼組中在腹脂組織差異表達的基因和在肝臟組織差異表達的基因進行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)有177個基因在兩種組織中都顯著差異表達(圖4A)。對這177個基因進行GO功能注釋，發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集于細胞分裂、細胞周期、有絲分裂、細胞周期調(diào)控等相關(guān)進程(圖4B)，表明高脂喂養(yǎng)可激活肝臟和腹脂中細胞增殖相關(guān)基因的表達。為驗證高通量測序結(jié)果的可靠性，本研究利用與測序相同的樣本，從這177個共同差異表達基因中隨機選擇7個與細胞周期相關(guān)的基因(和)進行qRT-PCR驗證。結(jié)果表明，在肝臟(圖4C)和腹脂(圖4D)中，高脂飼喂均可促進細胞周期相關(guān)基因的表達，這與測序結(jié)果相符，證實了測序結(jié)果的可靠性。

2.5 高脂培養(yǎng)基可促進雞肝臟細胞和前脂肪細胞的細胞周期進程

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂飼料可激活肝臟和腹脂組織中與細胞周期相關(guān)基因的表達，為了在體外驗證這一現(xiàn)象，本研究利用高脂培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基對雞肝癌細胞系LMH細胞和雞前脂肪細胞系ICP細胞進行培養(yǎng)，48 h后檢測細胞周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LMH細胞和ICP細胞中，高脂培養(yǎng)基都可顯著減少處于G1期的細胞數(shù)量，但能增加處于S期的細胞數(shù)量(圖5，A和B)。進一步對高脂培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h的細胞進行RNA提取，利用qRT-PCR檢測與細胞周期相關(guān)并且在肝臟和腹脂中都顯著差異表達的9個基因(、、、、、、、和)的表達情況。結(jié)果表明，在LMH細胞和ICP細胞中，高脂培養(yǎng)基都可顯著提高細胞周期相關(guān)基因的表達(圖5，C和D)。綜上所述，高脂培養(yǎng)基可促進家雞肝臟細胞和前脂肪細胞的細胞周期進程。

圖4 腹脂和肝臟中的共同差異表達基因顯著富集于細胞周期的相關(guān)進程

A：腹脂和肝臟中的共同差異表達基因韋恩圖注釋；B：腹脂和肝臟中的共同差異表達基因GO功能注釋；C：qRT-PCR驗證肝臟組織中7個與細胞周期相關(guān)基因的表達；D：qRT-PCR驗證腹脂組織中7個與細胞周期相關(guān)基因的表達。*<0.05，**<0.01。

圖5 高脂培養(yǎng)基可促進家雞肝臟細胞和前脂肪細胞的細胞周期進程

A：LMH細胞分別由高脂和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后細胞周期分布情況；B：ICP細胞分別由高脂和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后細胞周期分布情況；C：LMH細胞分別由高脂和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后細胞周期相關(guān)基因的表達情況；D：ICP細胞分別由高脂和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后細胞周期相關(guān)基因的表達情況。*<0.05，**<0.01。

3 討論

肥胖被認為是由能量攝入和消耗之間的長期不平衡而導(dǎo)致的脂肪量增加[13~15]。研究表明，肉雞腹部脂肪總重量直接受日糧能量水平的影響。高脂飼糧通過提高日糧能量水平對肉雞腹脂沉積有積極影響[16]。本研究用高脂飼糧對中國地方品種肉雞進行飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)可顯著增加腹脂重和腹脂率。對腹脂細胞的切片分析表明，這種腹脂重量的增加可能是通過增大腹脂細胞的體積來實現(xiàn)的。另一方面，本研究通過分析高脂飼糧和正常飼糧喂養(yǎng)肉雞的肝臟和腹脂中的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)還可激活細胞周期相關(guān)基因的表達，促進細胞周期進程。因此，推測高脂喂養(yǎng)所導(dǎo)致的腹脂含量增加，可能還通過促進腹脂細胞增殖，從而增加腹脂細胞的數(shù)量來實現(xiàn)。

體內(nèi)脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)受到多條代謝通路的調(diào)控，如PPAR信號通路、細胞外基質(zhì)受體(extracellular matrix receptor，ECM-receptor)通路、Wnt信號通路、胰島素信號通路等，而且這些通路可以相互作用形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的平衡[6]。在本研究結(jié)果中，包括PPAR信號通路和ECM-receptor通路都在差異表達基因的KEGG通路中富集。在脂代謝的研究中，PPAR家族對脂代謝的作用非常重要，其中關(guān)系最為密切的是PPARα，該蛋白主要分布于骨骼肌和肝臟[17]。PPARα是脂肪酸代謝的通用調(diào)節(jié)因子，對小鼠分別進行正常和高脂的飼喂，結(jié)果顯示高脂組PPARα、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1 (ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)、載脂蛋白AI (apolipoprotein A-I, ApoAI)在肌肉組織中的mRNA表達與正常組相比都顯著降低[18]。PPARα在血脂代謝中對降低血清甘油三酯(triglyceride, TG) 和升高高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cho-lesterol, HDL-C)有重要作用[19]?；蚰苷蛘{(diào)節(jié)前脂肪細胞的分化、脂肪酸氧化及脂質(zhì)代謝[20]。抑制能阻斷前脂肪細胞分化，抑制脂肪合成及沉積[20]。PPARγ是重要的細胞分化轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動物的脂肪組織中有豐富的表達[21]。研究發(fā)現(xiàn)PPAR在肝臟脂肪的合成中有重要的作用，并推測該基因是影響雞脂肪代謝的主效基因[22]。高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)肥胖過程中不同部位的脂肪細胞PPARγ和CCAAT增強子結(jié)合蛋白α (CCAAT enhancer-binding proteins, C/EBPα)蛋白的表達均顯著上調(diào)，說明高脂喂養(yǎng)可促進前脂肪細胞增殖和分化[23]，這與本研究結(jié)果類似。在對牛的不同軀體部位脂肪組織的差異表達基因進行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)ECM-receptor通路是各組差異表達基因中共同富集到的通路，同時也是許多富集通路中的1個子通路[24]。本研究中，高脂雞和普飼雞中腹脂組織差異表達基因也能富集于ECM-receptor通路中，表明該通路在不同物種中均可影響脂肪代謝相關(guān)進程。

Hammarstedt等[25]研究發(fā)現(xiàn)，鵝被填飼后，脂肪細胞中甘油三酯合成增加，脂肪細胞體積增大，這與本研究用高脂喂養(yǎng)肉雞的結(jié)果類似。脂肪細胞中甘油三酯過度堆積時，會引起脂肪細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝異常，脂肪酸的合成和氧化減弱，最終導(dǎo)致脂肪組織功能失調(diào)，甘油三酯異位沉積形成脂肪肝[26,27]。同時，高脂喂養(yǎng)會降低肝臟組織等對胰島素的敏感性，從而產(chǎn)生胰島素抵抗，誘發(fā)肝臟中甘油三脂的異位沉淀[28]。在瘦肉型和肥胖型肉雞肝臟基因表達差異分析中，發(fā)現(xiàn)差異表達基因與Wnt、胰島素信號和細胞周期通路有關(guān)，且這3個通路對雞脂質(zhì)代謝有重要影響[29]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)細胞周期通路與高脂誘導(dǎo)的雞腹脂沉積相關(guān)，高脂喂養(yǎng)可能通過激活肝臟和腹脂組織中肝細胞和前脂肪細胞的細胞周期進程，刺激脂肪代謝和脂肪細胞增加，最終導(dǎo)致腹脂沉積。在高脂飲食引起的小鼠肥胖中，脂肪生成對于脂肪組織的擴張起重要作用。高脂飲食可促進早期脂肪形成過程中細胞周期的重新進入，促進脂肪生成，導(dǎo)致脂肪組織擴張[30]。

脂肪含量的多少是由脂肪細胞的數(shù)量和單個脂肪細胞的體積來決定的。本研究發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)會導(dǎo)致單個脂肪細胞的體積增大。但沒有檢測高脂雞和普飼雞在腹脂細胞數(shù)量上的差異。利用22個月大的Spragua-Dawley雌性大鼠研究高脂肪飲食對前脂肪細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)高脂飲食可以刺激大鼠的前脂肪細胞增殖[31]。除此之外，也有其他研究表明高脂飲食會促進小鼠或大鼠中前脂肪細胞的增殖[32,33]。高脂飲食會促使血小板反應(yīng)蛋白-1 (thrombospon-dins-1, TSP-1)在小鼠脂肪組織發(fā)育中上調(diào)[34]，TSP-1是一種典型的基質(zhì)細胞蛋白[35]，在大多數(shù)正常成人組織中不表達，但在損傷、腫瘤和修復(fù)中的組織中顯著上調(diào)[36~38]。Kong等[39]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中TSP-1的上調(diào)會增加體重，并增強脂肪炎癥活性，其作用可能部分通過促進前脂肪細胞增殖來實現(xiàn)。因此，在肉雞中，高脂喂養(yǎng)所導(dǎo)致的腹脂增加可能與細胞周期或細胞增殖的激活緊密相關(guān)。

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The cell cycle pathway regulates chicken abdominal fat deposition as revealed by transcriptome sequencing

Jiahui Chen, Xueyi Ren, Limin Li, Shiyi Lu, Tian Cheng, Liangtian Tan, Shaodong Liang, Danlin He, Qingbin Luo, Qinghua Nie, Xiquan Zhang, Wen Luo

With the improvement of growth traits and feed conversion rate, the abdominal fat rate of Chinese local breeds of broilers has been increasing. Excessive abdominal fat deposition not only reduces the slaughter rate and disease resistance of broiler chickens, but also produces waste due to the difficulty of fat treatment. In order to study the regulatory genes and pathways involved in abdominal fat deposition of broilers, we used high-fat diets to feed the Xinghua Chicken, which is a Chinese local breed. Two weeks after feeding, we found that the abdominal fat weight and rate of broilers in the high-fat diet group increased significantly, and the diameter and area of abdominal fat cells also increased significantly. Transcriptome sequencing of abdominal fat and livers showed that the differentially expressed genes in the abdominal fat were mainly enriched in the cell cycle, peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) and extracellular matrix (ECM) receptor signaling pathways. The differentially expressed genes in livers were also significantly enriched in the cell cycle pathway, as well as in the steroid biosynthesis and PPAR signaling pathway. By analyzing the common differentially expressed genes in abdominal fat and liver tissues, we found that these genes were also enriched in cell cycle. Finally, we used the chicken LMH (chicken hepatoma cell) cell line and chicken ICP (immortalized chicken preadipocytes) cell line to do thevalidation assays. We used high-fat and common medium to culture the cells. The results showed that after 48 hours, the high-fat medium could significantly promote cell cycle and increase the number of cells in S phase. Additionally, qRT-PCR results showed that the high-fat medium could significantly promote the expression of genes related to cell cycle. In conclusion, we found that high-fat diets activate the cell cycle progressionof chicken hepatocytes and preadipocytes, promote cell proliferation, and then increase abdominal fat deposition.

Xinghua chicken; high-fat diet; abdominal fat deposition; cell cycle; differentially expressed genes

2019-04-09;

2019-07-05

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31702105)，國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位科學(xué)家項目(編號：CARS-41-G03)和廣州市科技計劃項目重點項目(編號：201804020088)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31702105), the China Agriculture Research System (No.CARS-41-G03), and the Science and Technology Program of Guangzhou, China (No.201804020088)]

陳家輝，本科生，專業(yè)方向：動物科學(xué)。E-mail: 1046755192@qq.com

任學(xué)義，本科生，專業(yè)方向：動物科學(xué)。E-mail: 935269360@qq.com

陳家輝和任學(xué)義并列第一作者。

羅文，博士，副教授，研究方向：家禽遺傳育種。E-mail: luowen729@scau.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-098

2019/10/10 15:41:19

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20191010.1100.001.html

(責(zé)任編委: 李輝)