馬 骉，鄭 超，黃麗芬，李安源，王家敏，毛崇輝，張明洲

(1.中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江省 生物計量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018)

近年來，隨著畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，畜禽感染細(xì)菌性疾病等問題日趨突出。抗生素過量使用甚至濫用帶來的 “超級耐藥菌”問題，已經(jīng)引起了全世界的廣泛關(guān)注[1-4]?；前奉愃幬锸且活惾斯ず铣煽咕帲瑢Υ蠖鄶?shù)革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑制作用[5]。由此產(chǎn)生的磺胺類耐藥微生物屢在畜禽體內(nèi)、糞便及肉制品中被檢出[6-7]?；诖?，對磺胺類耐藥基因的快速、精準(zhǔn)檢測，對于細(xì)菌耐藥性的控制具有非常重要的意義。

傳統(tǒng)生化方法由于檢測時間長、人工判讀檢測結(jié)果等原因，已滿足不了當(dāng)下快速檢測細(xì)菌耐藥性的需求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子檢測技術(shù)越來越多地應(yīng)用到實(shí)際生活中。PCR、熒光定量PCR和LAMP等方法都成功應(yīng)用于耐藥基因的檢測[8-11]。易污染、依賴精密儀器、低檢測效率等問題，制約著現(xiàn)場檢測的應(yīng)用推廣。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification, RPA)是一種在常溫下可以快速擴(kuò)增核酸的方法[12]。在25～42 ℃的等溫條件下，重組酶與寡核苷酸引物結(jié)合，形成引物和酶的復(fù)合體。酶促反應(yīng)使引物定位到DNA雙鏈模板上的同源靶序列，并在單鏈DNA結(jié)合蛋白的協(xié)助下解鏈模板 DNA。隨后在 DNA 聚合酶的作用下，形成新的DNA互補(bǔ)鏈[13-20]。橫向流動試紙條(lateral flow dipstick, LFD)是一種簡易的檢測裝置，可用于靶核苷酸的定性或半定量檢測[21-23]。當(dāng)結(jié)果為陽性時，可在檢測區(qū)內(nèi)形成肉眼可見的紅色條帶，無需借助儀器就可在現(xiàn)場或條件受限地區(qū)推廣[24]。RPA-LFD技術(shù)具有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、適用于現(xiàn)場快速診斷等特點(diǎn)，在動物疾病早期診斷、進(jìn)出口快速檢疫、動物食品安全衛(wèi)生等方面具有良好的應(yīng)用前景，已成為有效監(jiān)測和控制耐藥菌擴(kuò)散的強(qiáng)有力工具之一[25-26]。

本項(xiàng)目擬在前期研究工作基礎(chǔ)上，采用多重RPA-LFD技術(shù)對磺胺耐藥基因sul1，sul2和sul3進(jìn)行同步檢測，建立一種準(zhǔn)確、有效的多重快速檢測動物源大腸桿菌磺胺類耐藥基因的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所使用的部分樣本從養(yǎng)殖場宰殺的豬的糞便以及體表所提取，另外部分從農(nóng)貿(mào)市場取得，共計18組285個樣品(詳見表1)。所有菌株保存于浙江海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。LB Broth購自Sangon Biotech公司，Agar Powder 購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，基因組DNA提取試劑盒購自BioTeke公司，PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa公司，RPA相關(guān)試劑購自江蘇奇天基因生物科技有限公司。

1.2 DNA模板提取和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

細(xì)菌基因組DNA提取。取3 mL動物源大腸桿菌培養(yǎng)液置于1.5 mL的離心管中。加入Buffer GTL和 Proteinase K渦旋震蕩混勻，56 ℃孵育至溶液清亮。加入Buffer GL和無水乙醇，渦旋震蕩混勻后短暫離心后加入吸附柱，12 000 r/min離心1 min，棄廢液。加入500 μL Buffer GW1，12 000 r/min離心1 min。加入500 μL Buffer GW2，12 000 r/min離心1 min。吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干。將吸附柱置于離心管中，向吸附柱中加入50 μL Buffer GE，室溫放置3 min，12 000 r/min離心1 min，-20 ℃保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建。提取實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到并且含磺胺耐藥基因sul1，sul2，sul3的大腸桿菌ZFB1-2/17的總DNA，通過PCR克隆分別獲得sul1，sul2，sul3的基因片段并進(jìn)行純化(圖1)。使用TaKaRa公司 In fusion 產(chǎn)品，將目的片段與pET23a載體連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中培養(yǎng)。篩選單菌落后進(jìn)行測序驗(yàn)證，并使用MegAlign軟件比對校驗(yàn)。

M—DL2000 DNA Marker; P—陽性質(zhì)粒擴(kuò)增條帶; S—陽性樣本擴(kuò)增條帶; N—陰性對照; 1—sul1, 2—sul2, 3—sul3。圖1 目的基因片段PCR克隆電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of target gene fragment by PCR

1.3 RPA引物設(shè)計

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的sul1，sul2，sul3基因序列，使用primer primier5.0軟件，設(shè)計RPA引物，并交由Invitrogen公司合成。引物序列如下：

sul-1-F1：AAGACGCTCGACGAGATTGTGCGGTTCTT

sul-1-R1：AATAGCGGAAGCCCCAACGCCGACTTCAGCT

sul-2-F1：CATCGTCAACATAACCTCGGACAGTTTCTCG

sul-2-R1：GGTTGATAACTGTCGAGCGAGACGGGAATG

sul-3-F1：GCCGCTTCCAGTAATCCTGATACAACTGAA

sul-3-R1：TTTCTGGATTAGAGCCTAAAAAGAAGCCCATAC

1.4 反應(yīng)體系的優(yōu)化

在單重RPA反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，探索并優(yōu)化多重RPA反應(yīng)體系中各組分濃度及反應(yīng)參數(shù)，如醋酸鎂濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等。確定最優(yōu)反應(yīng)條件后，進(jìn)行靈敏度和特異性的測試。

分別對sul1，sul2，sul3的引物進(jìn)行熒光標(biāo)記(5’端分別標(biāo)記Biotin，Digoxin，F(xiàn)ITC基團(tuán))，RPA擴(kuò)增后產(chǎn)生不同熒光標(biāo)記的產(chǎn)物。在層析作用下，與標(biāo)記在試紙條上的對應(yīng)抗體結(jié)合，發(fā)生抗原抗體免疫反應(yīng)。通過單抗體的添加量、噴金量，樣品墊、NC膜和金墊等參數(shù)優(yōu)化，達(dá)到更好的肉眼識別效果。

1.5 多重RPA-LFD的特異性和靈敏度

以ZFB1-7/12(sul1)、ZFB1-5/14(sul2)、ZFB1-4/6(sul3)、ZFB1-9/7(sul1+sul2)、ZFB1-2/8(sul1+sul3)、ZFB1-8/9(sul2+sul3)、ZFB1-2/17(sul1+sul2+sul3)7種含有不同磺胺耐藥基因型的動物源大腸桿菌模板DNA為陽性對照，以不含磺胺耐藥基因的動物源大腸桿菌為陰性對照，分析多重RPA-LFD檢測方法的特異性。

將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別進(jìn)行三種磺胺類耐藥基因的靈敏度實(shí)驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行多重靈敏度實(shí)驗(yàn)。選取同時含有三種耐藥基因的大腸桿菌ZFB1-2/17作為多重RPA-LFD靈敏度實(shí)驗(yàn)的模板。同時使用qPCR方法驗(yàn)證其結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.6 多重RPA-LFD技術(shù)的評價

使用來自農(nóng)貿(mào)市場及養(yǎng)殖場采集的動物源大腸桿菌樣品，用于磺胺類耐藥基因多重RPA-LFD檢測方法的評價研究。提取樣品DNA后，采用優(yōu)化后的RPA-LFD體系進(jìn)行檢測，并與qPCR的檢出結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)比對分析，計算實(shí)際樣本中的耐藥基因檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重RPA-LFD擴(kuò)增體系優(yōu)化

多重RPA反應(yīng)體系(20 μL)如下：12.5 μL的2x Reaction Buffer、4.5 μL的dNTPs、0.8 μL SDW、2.5 μL的10x Basic E-mix、10 μM的Primer F、10 μM的Primer R、1.25 μL的20x Core Reaction Mix、1.25 μL的280 mM MgOAc、1 μL模板DNA。通過優(yōu)化，反應(yīng)的最優(yōu)溫度為40 ℃，反應(yīng)開始20 min后即可終止(圖2)。另外，優(yōu)化后的LFD顯色體系中，生物素單抗包被濃度為0.5 mg/mL，地高辛單抗標(biāo)記濃度為10 μg，噴金量為0.3 μL/cm、顯色時間控制在10 min。

a—反應(yīng)時間;b—反應(yīng)溫度;c—Mg2+濃度。圖2 多重RPA-LFD擴(kuò)增體系優(yōu)化Figure 2 Optimization of multiple RPA-LFD

2.2 多重RPA-LFD的靈敏度和特異性

在多重RPA擴(kuò)增體系中，分別加入含有sul1、sul2、sul3、sul1+sul2、sul1+sul3、sul2+sul3、sul1+sul2+sul3的不同磺胺耐藥基因型的動物源大腸桿菌模板DNA，對照組擴(kuò)增模板為不含磺胺耐藥基因的大腸桿菌目標(biāo)DNA，空白組擴(kuò)增模板為無菌水。擴(kuò)增反應(yīng)后，用試紙條進(jìn)行檢測(圖3)，結(jié)果顯示特異性良好。

在多重RPA擴(kuò)增體系中，加入分別含有sul1、sul2、sul3、sul1+sul2、sul1+sul3、sul2+sul3、sul1+sul2+sul3的不同磺胺耐藥基因型的動物源大腸桿菌模板DNA，模板進(jìn)行梯度稀釋，空白組加1μL無菌水。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多重RPA的靈敏度可以到達(dá)103copies/μL(圖4)。

圖3 多重RPA-LFD特異性檢驗(yàn)Figure 3 Specificity of multiple RPA-LFD

圖4 多重RPA-LFD靈敏度檢驗(yàn)Figure 4 Sensitivity of multiple RPA-LFD

2.3 實(shí)際樣本檢測結(jié)果的比對分析

對實(shí)驗(yàn)所使用的285株動物源大腸桿菌分離株進(jìn)行RPA-LFD檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計詳見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，動物源大腸桿菌中磺胺類耐藥基因檢出率達(dá)到81.05%(231/285)，其中含1種sul基因的菌株為41.40%(118/285)，含2種sul基因的菌株為31.23%(89/285)，含3種sul基因的菌株為8.42%(24/285)。這一結(jié)果與qPCR法檢測分析的結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

常規(guī)PCR、熒光定量PCR、LAMP等溫擴(kuò)增等方法已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌耐藥性檢測，具有較高的特異性和靈敏度。但常規(guī)PCR方法需要進(jìn)行電泳檢測，操作繁瑣且容易引起污染；熒光定量PCR方法對儀器要求較高；LAMP方法在等溫條件下擴(kuò)增，擺脫了對儀器的依賴，但存在假陽性現(xiàn)象且極易污染[27]。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)可以在較低的恒溫條件下，快速擴(kuò)增目的片段，在不依賴儀器設(shè)備的基礎(chǔ)上，可以克服樣本雜質(zhì)對擴(kuò)增效率的影響。同時，RPA對引物設(shè)計的要求較高，目前沒有相關(guān)設(shè)計軟件，只能靠人工判讀引物參數(shù)，進(jìn)而進(jìn)行引物篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)過多次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，建立了反應(yīng)時間短、操作簡單的多重RPA擴(kuò)增體系，僅需在40 ℃環(huán)境下孵育20 min即可使用試紙條顯色，顯色10 min即可肉眼觀察結(jié)果。同時利用qPCR方法做對比，靈敏度可以到達(dá)103CFU/mL，在保證特異性的同時，相較其他方法得到更穩(wěn)定、更精確的檢測結(jié)果。為有效避免污染，在實(shí)驗(yàn)過程中，必須嚴(yán)格遵循獨(dú)立工作區(qū)域單一方向操作原則，利用超凈工作臺進(jìn)行試劑配置與分裝，嚴(yán)格進(jìn)行消毒殺菌環(huán)節(jié)，防止交叉污染和操作不當(dāng)造成的污染，盡量避免假陽性結(jié)果。

通過本研究建立的磺胺類耐藥基因sul1，sul2和sul3的多重 RPA-LFD檢測技術(shù)，為動物源大腸桿菌及其耐藥性檢測提供了技術(shù)支持，對預(yù)防和切斷豬肉生產(chǎn)、加工、銷售中耐藥性細(xì)菌傳播有重要意義。同時，本文使用的方法，可為食品中其他致病微生物及其耐藥性基因的快速檢測研究提供了借鑒方法，使得食品中致病微生物及其耐藥性檢測向高通量、高靈敏、簡便經(jīng)濟(jì)的方向發(fā)展。