王麗昆 岳海龍 孫小強(qiáng) 劉陽 姜峰 畢庭民 劉燕 何艷舫

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，河北 唐山 063000；2開灤總醫(yī)院麻醉科；華北理工大學(xué) 3機(jī)能實(shí)驗(yàn)室；4附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科)

糖蛋白(GP)130基因表達(dá)于樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種細(xì)胞中〔1〕，由細(xì)胞因子、免疫球蛋白氧結(jié)構(gòu)域及3個(gè)纖連蛋白功能域組成，各結(jié)構(gòu)域和功能域在信號傳導(dǎo)中均發(fā)揮重要作用〔2〕。白細(xì)胞介素(IL)-6可由上皮細(xì)胞及T細(xì)胞分泌，在銀屑病患者皮損組織和血清中的含量明顯高于正常皮膚組織，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡，促進(jìn)表皮內(nèi)T細(xì)胞聚集，誘發(fā)銀屑病皮損〔3〕。Janus激酶(JAK)-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)3信號通路是IL-6轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮調(diào)控作用的主要途徑，而GP130基因是溝通二者的重要橋梁，同時(shí)也與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔4〕。本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)HaCaT人永生化表皮細(xì)胞，特異性降低GP130基因表達(dá)，觀察對細(xì)胞增殖和IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 HaCaT人永生化表皮細(xì)胞購于南京科佰生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(0.25%)購于北京睿嘉生物科技有限公司；GP130、IL-6、β-actin引物由南京科佰生物科技有限公司合成；兔GP130、IL-6、β-actin多克隆抗體及羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G抗體購于上海信裕生物科技有限公司。

1.2siRNA制備與分組 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成3組GP130 siRNA序列、陰性序列，依次分為siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA-nc，并設(shè)立空白對照組。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HaCaT細(xì)胞以DMEM常規(guī)培養(yǎng)，每48 h換液1次，觀察細(xì)胞融合80%以上時(shí)傳代，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞按5×105個(gè)/ml的密度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)胞融合70%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；根據(jù)說明書中siRNA的濃度范圍(50～200 pmol/L)每組選擇80、120、150 pmol/L三個(gè)濃度進(jìn)行優(yōu)化，選取最佳siRNA組別和濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞增殖檢測 采用噻唑藍(lán)(MTT)法，細(xì)胞以5×103個(gè)/ml的密度接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)胞融合70%～90%時(shí)，使用siRNA1、siRNA-nc轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并設(shè)空白對照，轉(zhuǎn)染24 h、48 h時(shí)加入5 g/L的MTT 20 μl/孔，培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl/孔，振蕩混勻，490 nm處讀取各孔吸光度值。

1.5細(xì)胞周期檢測 使用流式細(xì)胞儀檢測，收集siRNA1、siRNA-nc、空白對照組細(xì)胞，離心后棄上清，加入70%乙醇1 ml，混勻后-20℃靜置過夜；離心后棄上清，磷酸鹽緩沖液洗去細(xì)胞殘留乙醇，磷酸鹽緩沖液0.5 ml重懸細(xì)胞，滴加DNA提取緩沖液，室溫下放置5 min，離心后棄上清。滴加DNA染色液0.5 ml，室溫下避光靜置30 min，上流式細(xì)胞儀分析。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測 Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法定量，各取總RNA 1 μg行逆轉(zhuǎn)錄，取產(chǎn)物2 μg進(jìn)行PCR，GP130上游引物：5′-AACTCTTCTGAACCTGACTG-3′，下游引物：5′-TCTACCGCCACTACCATA-3′，擴(kuò)增條帶109 bp；IL-6上游引物：5′-GAACAAGGAGTGATGAGAGT-3′，下游引物：5′-GTTGAGTAGAGTA AGACG C-3′，擴(kuò)增條帶190 bp；β-actin上游引物：5′-GAAACGCCTACAGGTGCAGT-3′，下游引物：5′-GGAGCGACAGGTGGAAGGTC-3′，擴(kuò)增條帶207 bp。反應(yīng)條件：95℃ 5 min、95℃ 15 s、60℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物行溶解曲線分析，2-△△Ct法測定結(jié)果。mRNA抑制率表示各濃度siRNA的沉默效果。

1.7Western印跡檢測蛋白水平 放射免疫沉淀(RIPA)裂解液裂解siRNA1、siRNA-nc、空白對照組細(xì)胞，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，上樣量50 μg，GP130蛋白進(jìn)行8%分離膠十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電脈(PAGE)，IL-6蛋白進(jìn)行12%分離膠SDS-PAGE，濕法轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，一抗(1∶500)4℃孵育過夜，二抗(1∶3 000)37℃孵育2 h，洗膜后暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)觀察，蛋白表達(dá)水平使用目標(biāo)條帶與對應(yīng)β-actin條帶灰度值的比值表示。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS24.0軟件進(jìn)行t、F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1siRNA對GP130基因的抑制效率 120 pmol/L的siRNA1序列對GP130基因沉默效果最明顯，基因表達(dá)水平最低，抑制率最高。提示成功篩選出了沉默GP130基因表達(dá)的siRNA序列，選取120 pmol/L的siRNA備用。見表1。

表1 不同濃度和序列的siRNA對GP130基因表達(dá)的沉默效果

2.2120 pmol/L siRNA1沉默GP130基因效果驗(yàn)證 轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞48 h時(shí)提取蛋白，120 pmol/L siRNA1序列可下調(diào)GP130蛋白表達(dá)水平至1.83±0.28，明顯低于陰性對照組、空白對照組的4.91±0.54、4.78±0.40(P<0.05)。見圖1。

圖1 120 pmol/L siRNA1對GP130蛋白表達(dá)的影響

2.3沉默GP130基因?qū)?xì)胞增殖的影響 培養(yǎng)24 h時(shí)siRNA1組、siRNA-nc組、空白對照組HaCaT細(xì)胞吸光度值分別為0.18±0.03、0.20±0.05、0.21±0.07，三組HaCaT細(xì)胞增殖率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)48 h時(shí)HaCaT細(xì)胞吸光度值分別為0.28±0.07、0.46±0.12、0.50±0.10，siRNA1組HaCaT細(xì)胞增殖率明顯低于siRNA-nc組、空白對照組(P<0.05)。

2.4沉默GP130基因?qū)?xì)胞周期的影響 培養(yǎng)24 h時(shí)G1期、S期、G2期的HaCaT細(xì)胞水平在siRNA1組、siRNA-nc組、空白對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)48 h時(shí)siRNA1組G1期HaCaT細(xì)胞數(shù)量明顯高于siRNA-nc組、空白對照組，S期和G2期細(xì)胞數(shù)量明顯低于siRNA-nc組、空白對照組(P<0.01)；培養(yǎng)48 h時(shí)siRNA1組G1期細(xì)胞數(shù)量明顯高于培養(yǎng)24 h時(shí)，G2期細(xì)胞數(shù)量明顯低于培養(yǎng)24 h時(shí)(P<0.01)。見表2。

表2 沉默GP130基因?qū)?xì)胞周期的影響

與培養(yǎng)24 h時(shí)相比：1)P<0.05；表3同

2.5沉默GP130基因?qū)?xì)胞IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 培養(yǎng)24 h時(shí)siRNA1組、siRNA-nc組、空白對照組IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)水平之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)48 h時(shí)siRNA1組IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于siRNA-nc組、空白對照組(P<0.01)；培養(yǎng)48 h時(shí)siRNA1組IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于培養(yǎng)24 h時(shí)(P<0.05)。見表3。

表3 沉默GP130基因?qū)?xì)胞IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

銀屑病患者皮損組織中高水平的IL-6與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)〔5〕； IL-6可與GP130結(jié)合形成復(fù)合物，激活JAK-STAT3信號通路，調(diào)控下游靶基因表達(dá)，在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡的同時(shí)還能夠促進(jìn)表皮內(nèi)T細(xì)胞聚集，誘發(fā)銀屑病皮損〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，濃度為120 pmol/L的siRNA1序列沉默GP130基因表達(dá)的效果最明顯。

本文結(jié)果提示，GP130基因低表達(dá)可能通過抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成來降低HaCaT細(xì)胞增殖速率；也可能與轉(zhuǎn)染48 h時(shí)IL-6合成下降，間接影響HaCaT細(xì)胞增殖有關(guān)。GP130與IL-6結(jié)合后可經(jīng)JAK-STAT3信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h時(shí)，沉默GP130基因尚未影響GP130蛋白合成。GP130基因介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路可能調(diào)控HaCaT細(xì)胞中IL-6表達(dá)水平，且該調(diào)控作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，影響HaCaT細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。