郭蘇蘭 李佳娜 肖水秀

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 518110)

缺血性腦血管病(ICVD)是一種比較常見的高致殘性和高致死性的心腦血管疾病，嚴(yán)重危害人類健康。腦組織缺血可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生不可逆的死亡，如發(fā)生腫脹、 裂解、細(xì)胞器游離等病理改變，進(jìn)一步引起細(xì)胞的自噬、凋亡和壞死〔1〕。而腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指缺血腦組織恢復(fù)血流后，神經(jīng)細(xì)胞損傷和功能不但沒有恢復(fù)，反而進(jìn)一步加重的現(xiàn)象〔2〕。臨床上常常通過溶栓治療方法防治缺血性腦病，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完成闡明，可能與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡、興奮性氨基酸毒性作用、等氧化應(yīng)激等有關(guān)〔3〕。目前臨床上對CIRI的防治尚無特效藥物或手段，因此，尋找新的藥物來防治腦缺血再灌注損傷是非常必要的。貝母素甲(PM)為貝母的主要活性成分之一，屬于生物堿類物質(zhì)〔4〕。研究表明〔4〕PM具有明顯的抗炎作用。目前，關(guān)于PM對CIRI的作用及其機(jī)制未見相關(guān)研究報道。本研究旨在探討PM是否通過影響CIRI的炎癥反應(yīng)和自噬機(jī)制而起保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1動物 實驗動物為健康C57BL小鼠144只，SPF級，雌雄各半，體重18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK(粵)2015-0004。

1.2藥物與試劑 PM：阿拉丁試劑有限公司；阿司匹林片(ASA，規(guī)格 0.3 g/片，丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公司)；腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒、白細(xì)胞介素(IL)1β ELISA檢測試劑盒和IL-10 ELISA檢測試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司)；總蛋白定量測試盒(南京建成股份有限公司)；尼龍栓線(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)；氯化三苯四氮唑(TTC，Sigma-Aldrich)。小鼠源單克隆LC3-Ⅱ抗體(Nanotools 0231-100/LC3-5F10)，兔單克隆β-arresting抗體(ab32099)(Abcam)，兔單克隆Beclin-1抗體(Cell Signaling Technology)，內(nèi)參照為小鼠源單克隆β-actin抗體(碧云天AA128)。

1.3造模及分組 動物按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、ASA組、PM 低、中、高劑量組(PM-L組、PM-M組、PM-H組)各24只。各組于造模前連續(xù)灌胃給藥3 d，ASA組小鼠灌胃給藥2 mg/(kg·d)，PM低、中、高劑量組小鼠分別灌胃給藥1 mg/(kg·d)，2 mg/(kg·d)，4 mg/(kg·d)，假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃給予等量生理鹽水。各組小鼠末次給藥3 h后，參照文獻(xiàn)〔5〕方法造模。主要方法如下：2%異戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將小鼠仰臥固定于37℃手術(shù)臺，小心將頸部毛發(fā)剃去，并使用75%酒精消毒剃毛皮膚，頸部正中縱向切開長約1.5 cm的皮膚，暴露和分離頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，然后將頸外動脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，頸外動脈遠(yuǎn)心端剪一小口，并將尼龍拴線于剪口處插入，輕輕伸入頸內(nèi)動脈，微遇阻力后立即停止推進(jìn)，固定栓線。缺血30 min后，小心拔出尼龍拴線，再灌注24 h，建立小鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：小鼠清醒后出現(xiàn)同側(cè)Horner征和對側(cè)上肢重于下肢的癱瘓癥狀。

1.4神經(jīng)功能學(xué)評分 按照Longa等〔6〕5分制法對各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)評分。評分方法如下：無精神損傷癥狀計為0分；未能完全伸展對側(cè)前爪計為1分;向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈計為2分；向?qū)?cè)傾倒計為3分；不能自發(fā)行走，意識喪失計為4分。其中0分視為造模不成功，造模后死亡或昏迷2 h以上小鼠均視為造模失敗，不計入動物結(jié)果。

1.5腦梗死體積測定 小鼠2%異戊巴比妥鈉麻醉后，并頸椎脫臼處死，開顱小心取腦，使用30 ml生理鹽水分別沖洗3次，將腦組織放于-20℃冰凍30 min，將腦置于腦膜具，分別于額極向枕極行冠狀切片，厚度均為2 mm，共5片，0.5% TTC染液37℃避光孵育30 min，掃描儀掃描，使用Image-Pro Plus圖像分析處理軟件計算和統(tǒng)計腦梗死率，其中腦梗死率=梗死面積/總面積×100%。

1.6腦組織形態(tài)學(xué)觀察 4%多聚甲醛固定腦組織，自來水流水浸泡24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，片厚5 μm，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察腦組織海馬齒狀回形態(tài)學(xué)變化。

1.7腦水含量測定 小鼠開顱取腦后，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，準(zhǔn)確稱量并計為濕重，然后把腦組織置于105℃恒溫干燥箱干烤72 h，并準(zhǔn)確稱取腦組織計為干重，腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.8腦組織炎癥因子的測定 使用玻璃勻漿器，按照1∶9的質(zhì)量體積比〔腦組織(g)∶生理鹽水(ml)〕制備10%腦組織勻漿液，并離心(4℃，3 000 r/min，5 min)取上清液，按照試劑盒操作步驟測定腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-10。

1.9自噬蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和β-arrestin的表達(dá)檢測(Western印跡) 小心分離出缺血側(cè)半球腦皮質(zhì)，加入適量放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液，使用玻璃勻漿器于冰上勻漿，離心(10 000 r /min，4℃，40 min)，取上清即為檢測樣品。二喹啉甲酸(BCA)法定量檢測蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂牛奶封閉4 h，分別加入一抗β-arrestin (1∶800)，LC3-Ⅱ(1∶200)，Beclin-1(1∶800)和內(nèi)參β-actin(1∶4 000)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，化學(xué)發(fā)光檢測(ECL)試劑盒顯色檢測蛋白條帶。以β-actin 灰度值作為內(nèi)參照，采用 quantity one Image J 軟件進(jìn)行圖像灰度值分析。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1行為學(xué)評分觀察 與假手術(shù)組〔(0.00±0.00)分〕比較，模型組小鼠行為學(xué)分?jǐn)?shù)〔(3.75±0.34)分〕明顯升高(P<0.01)，表現(xiàn)為小鼠向左側(cè)傾倒或旋轉(zhuǎn)，觀察左側(cè)前爪不能完全伸展，甚至不能行走。與模型組比較，ASA組和PM-L、PM-M、PM-H組行為學(xué)分?jǐn)?shù)均明顯降低〔(2.45±0.32)分、(3.12±0.31)分、(2.32±0.25)分、(2.22±0.23)分，P<0.05〕，各給藥組小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)均明顯改善。與PM-L組比較，PM-H組小鼠行為學(xué)分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.05)。

2.2腦梗死體積觀察 與假手術(shù)組〔(0.00±0.00)%〕比較，模型組小鼠腦梗死率顯著升高〔(45.21±4.23)%，P<0.01〕。與模型組比較，ASA組和PM-L、PM-M、PM-H給藥組小鼠腦梗死率明顯降低〔(25.45±3.24)%、(30.54±3.25)%、(23.48±2.16)%、(12.35±1.98)%，P<0.05〕。與PM-L組比較，PM-H組小鼠腦梗死率明顯降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 腦梗死體積觀察(TTC染色)

2.3腦組織海馬齒狀回觀察 假手術(shù)組海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列正常，細(xì)胞層數(shù)多，細(xì)胞飽滿，可見深染的核仁。模型組海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞層明顯縮小，排列紊亂，胞質(zhì)濃縮，核固縮。而ASA組和PM給藥組神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況明顯改善，神經(jīng)細(xì)胞層數(shù)較多，排列較整齊。見圖2。

2.4腦水含量觀察 與假手術(shù)組〔(0.10±0.01)%〕比較，模型組小鼠腦組織含水量顯著升高〔(1.31±0.12)%，P<0.01〕。與模型組比較，ASA組和PM-L、PM-M、PM-H給藥組小鼠腦組織含水量明顯降低〔(0.67±0.14)%、(0.18±0.12)%、(0.62±0.15)%、(0.41±0.13)%，P<0.05〕。與PM-L組比較，PM-H組小鼠腦組織含水量明顯降低(P<0.05)。

圖2 腦組織海馬齒狀回觀察(HE，×20)

2.5腦勻漿TNF-α、IL-1β、IL-10含量觀察 模型組小鼠腦勻漿TNF-α和IL-1β含量較假手術(shù)組明顯升高，而IL-10含量明顯降低(P<0.01)。ASA組和PM給藥組小鼠腦勻漿TNF-α和IL-1β含量較模型組明顯降低，而IL-10含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)。PM-H組小鼠腦勻漿TNF-α和IL-1β含量明顯較PM-L組明顯降低，而IL-10含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腦勻漿TNF-α、IL-1β、IL-10含量變化

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05,3)P<0.01；與PM-L組比較:4)P<0.05

2.6缺血半暗帶區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)觀察 與假手術(shù)組(0.92±0.05)比較，模型組小鼠缺血半暗帶區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯降低(0.25±0.02，P<0.01)。與模型組比較，ASA組和PM-L、PM-M、PM-H給藥組小鼠缺血半暗帶區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯升高(0.53±0.03、0.47±0.04、0.72±0.04、0.84±0.06，P<0.01)。與PM-L組比較，PM-H組小鼠缺血半暗帶區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。見圖3。

1～6：假手術(shù)組、模型組、AS組、PM-L組、PM-M組、PM-H組圖3 缺血半暗帶區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)

3 討 論

行為學(xué)評分和腦梗死率觀察是評價模型成功和藥物有效性的直接簡便的觀察方法。本研究結(jié)果提示PM可明顯改善MCAO行為學(xué)和腦組織的壞死。腦缺血性腦功能障礙的主要原因為腦水腫，腦水腫也是腦缺血后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，是導(dǎo)致缺血性腦卒中患者死亡的最主要原因之一〔7〕。本研究提示PM可保護(hù)血腦屏障完整性，從而減輕腦水腫。研究發(fā)現(xiàn)〔8,9〕炎癥參與CIRI發(fā)生發(fā)展過程，其中TNF-α和IL-1β是炎癥的兩個重要因子，參與血腦屏障的通透性和促進(jìn)部分炎性介質(zhì)表達(dá)。發(fā)生時， TNF-α 可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，分泌大量 IL-1β，引起一系列的炎癥級聯(lián)反應(yīng)〔10〕，而IL-10 是一種抗炎因子，可減輕炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)PM給藥組可明顯抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕CIRI。自噬在機(jī)體的生理和病理過程中都能見到，正常機(jī)體中主要通過自噬作用清除胞內(nèi)受損的生物大分子和細(xì)胞器，對維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和細(xì)胞存活均有重要的意義。已有研究表明CIRI可抑制自噬過程，細(xì)胞過度損傷，進(jìn)一步引起細(xì)胞壞死〔11〕。而LC3-Ⅱ作為自噬水平的一個標(biāo)志物，常用于反映機(jī)體自噬水平高低的一個指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)PM給藥組可明顯促進(jìn)自噬，且呈劑量依賴性。