逯冉冉 耿建紅 張群英 付文玉 趙敏

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1神經(jīng)病學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；2組織與胚胎學(xué)教研室)

研究表明，腦缺血再灌注(I/R)損傷機(jī)制是一系列復(fù)雜的病理生理過程，急性腦I/R可導(dǎo)致嚴(yán)重的遲發(fā)性腦神經(jīng)元損傷，可能是由于缺血再灌注周圍腦組織發(fā)生炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，加劇了腦組織水腫和神經(jīng)元的進(jìn)一步損傷〔1,2〕。丁苯酞(NBP)是從芹菜籽中提取而來的有效成分，廣泛用于治療各種腦血管病。臨床研究發(fā)現(xiàn)，NBP在全面治療缺血性腦卒中有明顯減少梗死后神經(jīng)功能缺失、改善患者生活能力狀態(tài)的作用〔3〕，但NBP對(duì)腦I/R大鼠神經(jīng)元具體保護(hù)機(jī)制尚未十分明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立局灶性腦I/R大鼠模型檢測各組含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase8、β-連環(huán)蛋白(catenin)蛋白表達(dá)量，星型膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)改變，從而探討NBP的神經(jīng)元的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 NBP注射液(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供)，主要試劑包括caspase3、caspase8(Life Science試劑公司)、β-catenin(CST試劑公司)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗兔(abcom試劑公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 動(dòng)物選取清潔級(jí)健康的成年雄性SD大鼠60只，體重250～280 g，青島大任富城畜牧有限公司提供。動(dòng)物每籠3～4只飼養(yǎng)，室溫維持在(23±2)℃，自由攝水?dāng)z食。將大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)(Sham)組、模型(I/R)組、BNP低劑量(NBP1)組、NBP高劑量(NBP2)組。

1.3動(dòng)物模型的制備 參照Longa等〔4〕線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(MACO)的局灶性腦缺血模型。經(jīng)腹腔注射10%水合離醛麻醉大鼠。使其仰臥位置于手術(shù)操作臺(tái)上，頸部正中切口鈍性分離頸下皮膚肌肉，充分暴露一側(cè)的頸部動(dòng)脈。分離頸內(nèi)外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外血管，將魚線由頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)血管到達(dá)大腦中動(dòng)脈。魚線至頸內(nèi)外分叉口18 mm，結(jié)扎頸總動(dòng)脈。檢查無出血后，依次縫合頸部組織和皮膚，1.5 h后拔出栓線，放置籠中觀察直至清醒，并正常飼養(yǎng)。NBP1組和NBP2組大鼠分別在術(shù)后6 h、12 h、24 h腹腔注射BNP溶液(4 mg/kg、6 mg/kg)，Sham組和I/R組注射等量生理鹽水。

1.4大鼠行為學(xué)評(píng)分及腦組織含水量測定 大鼠再灌注24 h后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，參照文獻(xiàn)〔5〕評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分，輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展向?qū)?cè)前爪；2分，重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。評(píng)分后將大鼠立即斷頭處死，取缺血側(cè)腦組織迅速稱其濕重，然后置于100℃高溫烤箱內(nèi)，烘干48 h后稱其干重。按照Elliott公式，計(jì)算腦含水量，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5免疫熒光組織化學(xué)染色 各組SD大鼠缺血再灌注24 h后每組隨機(jī)選取5只，用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉。由左心室進(jìn)針入升主動(dòng)脈剪開右心耳，生理鹽水200 ml快速?zèng)_凈血液，4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PBS)400 ml緩慢灌注固定后取腦；將腦組織依次放置濃度為20%、30%蔗糖溶液梯度沉糖脫水2次。包埋劑包埋腦組織，冰凍切片機(jī)切片厚度10 μm；采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(SP)法進(jìn)行免疫組化染色，冰凍切片室溫下復(fù)溫20 min，PBS洗滌3次×5 min，山羊血清封閉30 min，滴加一抗4℃過夜，次日復(fù)溫30 min，PBS洗滌3次×5 min；熒光二抗避光孵育1 h，PBS避光洗滌3次×5 min，Hoechest33258避光染色30 min，PBS避光洗滌3次，抗免疫熒光劑封片。在熒光顯微鏡400倍視野下，采集拍照；采用 Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析，測定平均光密度值(IOD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6Western印跡檢測蛋白水平 各組大鼠缺血再灌注24 h后，麻醉斷頭處死，迅速取出缺血側(cè)腦皮質(zhì)。 加入蛋白組織裂解液冰上研磨勻漿，提取各組樣本的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量，將各組蛋白終濃度調(diào)整一致。采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)垂直板全濕法電泳，上樣，電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，放入含 5%脫脂牛奶的TBST封閉緩沖液中封閉2 h后加入稀釋的一抗(1∶1 000)。一抗4℃搖床孵育過夜，室溫下復(fù)溫1 h，充分洗膜后加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜后發(fā)光液化學(xué)發(fā)光，使用膠片進(jìn)行曝光。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組β-catenin、caspase3、caspase8蛋白表達(dá) 各組皮質(zhì)區(qū)均能檢測到β-catenin、caspase3、caspase8蛋白條帶。I/R組caspase3、caspase8的蛋白表達(dá)量明顯高于Sham組，而β-catenin卻顯著低于Sham組(P<0.05)。NBP1組和NBP2組與I/R組相比，明顯下調(diào)了β-catenin蛋白，降低了caspase3、caspase8蛋白的表達(dá)量(P<0.05)。NBP2組與NBP1相比caspase3、caspase8蛋白顯著降低，β-catenin顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1、表1。

組別Caspase3Caspase8β-cateninSham組0.03±0.040.10±0.050.93±0.11I/R組0.24±0.071)0.42±0.091)0.59±0.0081)NBP1組0.17±0.052)0.33±0.062)0.66±0.0062)NBP2組0.13±0.082)3)0.26±0.072)3)0.75±0.072)3)

與Sham組比較：1)P<0.05；與I/R組比較：2)P<0.05；與NBP1組比較:3)P<0.05；下表同

2.2神經(jīng)功能評(píng)分和腦水腫含水量測定 Sham組未觀察到任何神經(jīng)功能損傷，NBP1組及NBP2組評(píng)分明顯低于I/R組，且NBP2組顯著低于NBP1組(P<0.05)。NBP1組及NBP2組腦含水量均顯著低于I/R組(P<0.05)，且NBP2組顯著低于NBP1組(P<0.05)。見表2。

表2 各組行為學(xué)評(píng)分及腦組織含水量比較

2.3NBP對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的影響 I/R組星型膠質(zhì)細(xì)胞肥大，增生，胞核深染，呈過度激活狀態(tài)。NBP1組及NBP2組星型膠質(zhì)細(xì)胞僅少量細(xì)胞激活，隨著劑量增加細(xì)胞激活量降低，兩組激活程度均顯著低于I/R組(P<0.05)。I/R組大部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，細(xì)胞核變小，核染色質(zhì)高度凝集甚至破碎，呈強(qiáng)亮色熒光；NBP1組及NBP2組強(qiáng)熒光細(xì)胞即凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組GFAP和Hoechest染色積分光密度(IOD)值比較

圖2 大鼠腦缺血再灌注24 h后各組星型膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)和細(xì)胞核破碎程度表達(dá)(×400)

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，NBP在阿爾茨海默病和腦卒中動(dòng)物模型中都具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用〔6，7〕。BNP治療缺血性腦卒中作為一個(gè)多目標(biāo)神經(jīng)保護(hù)活性劑，通過減少氧化損傷和抑制炎癥反應(yīng)，顯著改善線粒體功能減少神經(jīng)元凋亡〔8〕。目前NBP已廣泛應(yīng)用于臨床治療腦卒中患者并有顯著成效，NBP不僅能夠改善患者急性腦損傷而且可以改善腦卒中后導(dǎo)致行走、肢體運(yùn)動(dòng)方面的殘疾及感覺、語言和記憶力等〔9,10〕。

當(dāng)腦組織血流中斷后依次會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，最終引起神經(jīng)元死亡，當(dāng)缺血一定時(shí)間后再灌注會(huì)進(jìn)一步加劇凋亡程度〔11〕。細(xì)胞凋亡是腦I/R損傷最嚴(yán)重結(jié)果，其中caspase基因家族中的caspase3和caspase8在細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔12〕。研究表明在短暫局灶性腦缺血大鼠中 β-catenin表達(dá)下降，影響細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)〔13〕。β-catenin蛋白對(duì)神經(jīng)元和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起重要作用，在胚胎發(fā)育過程中Wnt蛋白主要通過調(diào)節(jié)β-catenin控制基因轉(zhuǎn)錄和激活〔14〕。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，其中主要是通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、裂解及細(xì)胞間的極性和連接〔11〕。當(dāng)β-catenin突變的胚胎發(fā)育過程中去除β-catenin基因可誘發(fā)凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)脊細(xì)胞、感覺神經(jīng)元、背根神經(jīng)節(jié)、后腦等組織的損傷〔15，16〕。此外，結(jié)腸腺瘤樣息肉病基因(APC)作用于β-catenin，降解清除β-catenin后導(dǎo)致核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(LEF)的轉(zhuǎn)活減少，當(dāng)TCF/LEF失活后APC基因可進(jìn)一步誘導(dǎo)caspase3、caspase7和 caspase8的激活及增強(qiáng)聚合酶(PARP)分裂導(dǎo)致細(xì)胞凋亡易發(fā)性〔17〕。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦I/R 24 h后BNP組行為學(xué)評(píng)分和腦水腫程度均低于I/R組，進(jìn)一步證實(shí)NBP對(duì)大鼠腦I/R損傷有顯著保護(hù)作用。NBP預(yù)處理后上調(diào)了β-catenin表達(dá)量，降低了細(xì)胞激活和凋亡的程度，并隨著濃度的升高保護(hù)作用加強(qiáng)。

綜上所述，NBP可能是通過上調(diào) β-catenin蛋白表達(dá)，同時(shí)減弱APC基因?qū)aspase3和caspase8的活化，來降低星型膠質(zhì)細(xì)胞過度激活和神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)腦I/R大鼠神經(jīng)元損傷和細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用。