王慧選 徐敏紋 鹿莉 殷寒秋 殷松樓 馬華

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，江蘇 徐州 221000)

間質(zhì)性肺病(ILD) 是以不同程度的肺泡炎癥和肺纖維化為病理特征的一類肺部疾病。約1/3的ILD患者繼發(fā)于結(jié)締組織疾病，ILD常導(dǎo)致肺功能降低，5年生存率為20%〔1〕。已知成纖維細(xì)胞在ILD病理發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，循環(huán)纖維細(xì)胞是成纖維細(xì)胞的重要來源之一〔2〕。雖然有研究將循環(huán)纖維細(xì)胞作為ILD的生物學(xué)標(biāo)志物〔3〕，但尚未得到廣泛共識(shí)。血清Ⅱ型肺泡表面抗原(KL)-6糖蛋白為ILD病理進(jìn)展和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物〔4，5〕。本實(shí)驗(yàn)觀察博來霉素(BLM)誘導(dǎo)的ILD 小鼠不同病程階段外周血循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量和KL-6濃度的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1材料 9～10周齡SPF級(jí)雌性昆明小鼠40只(購于徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，重量(20.00±0.93)g。戊巴比妥鈉購于北京索萊寶科技有限公司；BLM針劑為日本化藥株式會(huì)社，15 mg/支；固定與透膜試劑盒、Percp 標(biāo)記抗小鼠 CD45 購自BD公司；兔抗小鼠Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)抗體購自Rockland 公司；熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自上海貝博生物；小鼠KL-6酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司；Masson染色試劑盒和羥脯氨酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所；流式細(xì)胞儀為BD LSRFortessaTM Cell Analyzer。

1.2分組與模型建立 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為模型組(A組)和對(duì)照組(B組)各20只。適應(yīng)性飼養(yǎng)后腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)，麻醉后切開頸部逐層分離組織暴露氣管。A組用1 ml注射器吸取5.0 mg/kg的BLM溶液，緩慢滴入氣管，滴入過程中將小鼠直立，使BLM溶液在肺內(nèi)分布均勻，同時(shí)觀察小鼠呼吸情況。B組小鼠經(jīng)氣管滴入等體積的生理鹽水作為陰性對(duì)照。

1.3循環(huán)纖維細(xì)胞檢測(cè) 兩組均在BLM給藥后第7、14、21、28天眼球取血法各處死5只，取200 μl肝素鈉抗凝血于流式管中，CD45單抗25 ml(0.02 mg/ml)，渦旋器震蕩混勻，室溫避光孵育15 min；離心機(jī)2 000 r/min離心5 min后，加入固定透膜液500 μl(1∶1)，4℃孵育20 min；每管加透膜洗滌液1 ml(1∶10)，2 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)上述操作1次；每管加兔抗小鼠ColⅠ抗體2 μl(0.01 mg/ml)，4℃避光孵育30 min，洗滌2次；每管加FITC 標(biāo)記的山羊抗兔抗體27 μl(0.04 mg/ml)于管底，4℃避光孵育30 min，洗滌2次后，最后以300 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每管獲取1×105個(gè)細(xì)胞，原始數(shù)據(jù)采用FloJo-V10軟件處理。

1.4血清KL-6檢測(cè) 將取得的全血8 000 r/min離心5 min，取血清。按小鼠KL-6酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中KL-6濃度。

1.5肺組織炎癥、纖維化程度的病理學(xué)分析 右肺組織經(jīng)4%多聚甲醛通用型組織固定液固定、脫水、石蠟包埋，石蠟切片機(jī)制作3 μm的石蠟切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色及按照Masson染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。觀察肺組織炎癥改變，觀察肺組織膠原沉積情況。肺部炎癥評(píng)分：0分為無炎癥細(xì)胞，1分為少量炎癥細(xì)胞，2分為輕度炎癥，3分為中度炎癥，4分為重度炎癥；肺部纖維化評(píng)分采用Ashcroft半定量法〔6〕：0分為正常的肺組織；1分為肺泡或細(xì)支氣管壁輕微增厚；3分為細(xì)支氣管壁或肺泡壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)無明顯破壞；5分為纖維化程度增加，肺泡結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，有小纖維團(tuán)形成；7分為肺泡結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，大面積纖維化；8分為肺幾乎完全纖維化(2、4、6分為1、3、5分的過渡階段)。

1.6肺組織羥脯氨酸測(cè)定 取左肺組織按照羥脯氨酸試劑盒說明書進(jìn)行操作，分光光度儀檢測(cè)羥脯氨酸含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理學(xué)改變 HE染色顯示：A組第7天肺間隔增寬且有大量炎癥細(xì)胞浸潤；14 d肺部組織基本消失，肺泡結(jié)構(gòu)幾乎不可見；第21天肺部斑片化；28 d斑片面積減少。B組各個(gè)時(shí)期病理改變較A組輕(圖1)。Masson染色顯示：A組第7天開始出現(xiàn)少量膠原纖維沉積，到14 d達(dá)到最高，隨后逐漸減少。B組各時(shí)期的膠原纖維沉積程度較A組輕(圖2)。

2.2肺部炎癥及纖維化評(píng)分 A組炎癥評(píng)分在第7、14、21天時(shí)均顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，A組纖維化評(píng)分各時(shí)期均顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.3羥脯氨酸含量 A組羥脯氨酸含量在第14天達(dá)到最高，隨后逐漸下降，A組各時(shí)期羥脯氨酸含量均顯著高于B組(P<0.01)，見表2。

2.4外周血循環(huán)纖維細(xì)胞 A組循環(huán)纖維細(xì)胞第7天達(dá)到最高，在第7、14、21天均顯著高于B組(P<0.01)，見表3。

圖1 兩組肺組織HE染色(×200)

圖2 兩組肺組織Masson染色(×200)

組別炎癥評(píng)分第7天第14天第21天第28天纖維化評(píng)分第7天第14天第21天第28天A組2.80±0.571)3.60±0.421)2.60±0.421)1.50±0.793.00±0.621)3.80±0.571)4.20±0.571)3.20±0.571)B組0.90±0.420.70±0.270.30±0.270.30±0.270.80±0.270.50±0.350.20±0.270.10±0.22

與B比較:1)P<0.01；表2同

表2 兩組肺組織羥脯氨酸含量

表3 兩組外周血循環(huán)纖維細(xì)胞百分比

2.5血清KL-6濃度 A組血清KL-6濃度第21天達(dá)到最高，在第14、21、28 d顯著高于B組(P<0.05)，見表4。

2.6循環(huán)纖維細(xì)胞百分比與肺組織炎癥、纖維化評(píng)分、羥脯氨酸含量、血清KL-6濃度的相關(guān)性 Spearman分析結(jié)果顯示，循環(huán)纖維細(xì)胞百分比與肺組織炎癥評(píng)分、纖維化評(píng)分、羥脯氨酸含量、血清KL-6濃度呈正相關(guān)(r=0.631、0.676、0.764、0.454，n=40，P<0.01)。

表4 各組血清KL-6濃度

3 討 論

循環(huán)纖維細(xì)胞是存在于外周血中的一類新的白細(xì)胞亞型，在正常人群中占外周有核細(xì)胞的0.1%～1.0%。Hashimoto等〔7〕在BLM誘導(dǎo)長期移植表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的肺損傷模型中，發(fā)現(xiàn)肺部表達(dá)膠原的細(xì)胞很大比例是骨髓來源的外周循環(huán)纖維細(xì)胞。循環(huán)纖維細(xì)胞同時(shí)具有血源性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的特征，因此，標(biāo)志物CD45和ColⅠ雙陽性常用來鑒別循環(huán)纖維細(xì)胞〔8〕，本研究結(jié)果顯示外周血循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量變化與ILD病理進(jìn)展一致。由于循環(huán)纖維細(xì)胞具有上述特征，因此其有可能參與ILD的炎癥及纖維化進(jìn)程〔9〕，本研究提示循環(huán)纖維細(xì)胞可能參與BLM誘導(dǎo)小鼠ILD的炎癥和纖維化進(jìn)程。

KL-6是一種高分子量的肺細(xì)胞糖蛋白標(biāo)記物，在肺組織中由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞分泌，KL-6在肺組織細(xì)胞損傷反應(yīng)和再生后增加，在ILD中升高，參與ILD的病理生理過程。因此，KL-6常被作為ILD病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物〔5〕，既往臨床研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量與血清KL-6水平呈正相關(guān)，表明循環(huán)纖維細(xì)胞可作為ILD評(píng)估病情的生物學(xué)標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)未涉及循環(huán)纖維細(xì)胞參與ILD的機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究。因小鼠與人體的差異性，因此該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與臨床結(jié)果有差異，需進(jìn)一步臨床研究驗(yàn)證。