梁艷 呂康 何標

(安徽師范大學體育學院，安徽 蕪湖 241003)

阿爾茨海默病(AD)以異常積聚的老年斑為主要病理特征〔1〕。β淀粉樣蛋白(Aβ)主要是由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)在β-分泌酶(BACE-1)和γ-分泌酶(PS1)的作用下生成的，因此，APP 、BACE-1和PS1含量對Aβ的生成至關重要〔2〕。Aβ生成增多和清除能力下降是導致腦內(nèi)Aβ異常聚集的主要原因所在。降解酶降解和跨血腦屏障轉運清除是機體清除Aβ的主要形式〔3〕。Aβ降解酶主要有腦啡肽酶(NEP)和胰島素降解酶(IDE)等〔4〕。低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)-1是腦內(nèi)Aβ進入外周的主要受體，而晚期糖基化終末端產(chǎn)物受體(RAGE)是外周Aβ進入腦內(nèi)的主要載體〔5〕。腦內(nèi)Aβ清除障礙或清除速率下降使腦內(nèi)Aβ異常聚集加快，加速了AD的病理進程〔6〕。截至目前尚無有效治療AD的藥物及方法。已有研究證實，運動能夠有效改善AD的學習記憶能力，延緩AD的發(fā)生〔7～9〕。但運動延緩AD的作用機制尚不清楚。因此，本實驗擬通過12 w中等強度的跑臺運動，從Aβ的生成、降解和轉運清除3個方面研究運動對轉基因(Tg)APP/PS1小鼠海馬區(qū)Aβ含量的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物及分組 選購3月齡雄性Tg APP/PS1小鼠，置于標準動物房，適應性喂養(yǎng)2 w后隨機分為運動組(TE組)和安靜組(TC組)各12只。

1.2運動干預方案 TE組給予1 w的適應性訓練。適應性訓練結束后對TE組進行運動干預。運動強度參照文獻〔10〕，為最大攝氧量的45%～55%。每次訓練持續(xù)45 min，運動結束后小鼠為7月齡。

1.3取材 TE組末次運動后禁食12 h，脫頸處死，分離海馬。每組取6只用于蛋白質免疫印跡實驗，6只用于酶聯(lián)免疫吸附劑實驗。

1.4Aβ40和Aβ42質量濃度的檢測 按照文獻〔11〕操作步驟進行。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，在450 nm波長下測定光密度D(λ)值，通過標準曲線計算質量濃度。

1.5APP、PS1、NEP、LRP-1和RAGE蛋白相對表達水平的測定 按照文獻〔11〕操作步驟進行。取適量海馬區(qū)，勻漿，離心取上清，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和聚偏氟乙烯(PVDF)轉膜。牛奶封閉，加一抗稀釋液(LRP-1，ab92544，1∶500；RAGE，ab172473，1∶500；APP，CST2452，1∶1 000；PS1，Santa7860，1∶1 000；NEP，ab16050，1∶1 000)，孵二抗，AIpha成像系統(tǒng)曝光，ImageJ1.46進行灰密度值分析，計算目的蛋白相對表達水平。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1各組海馬區(qū)APP、PS1蛋白相對表達水平 TE組APP蛋白相對表達水平(1.31±0.13)顯著低于TC組(1.78±0.13，P<0.05)。TE組PS1蛋白相對表達水平(1.05±0.30)顯著低于TC組(2.10±0.37，P<0.05)。見圖1。

2.2各組海馬區(qū)LRP-1、RAGE、NEP蛋白相對表達水平 TE組LRP-1蛋白相對表達水平(3.32±0.26)顯著高于TC組(2.66±0.38，P<0.01)。TE組RAGE蛋白相對表達水平(0.25±0.04)顯著低于TC組(0.44±0.05，P<0.01)。TE組NEP蛋白相對表達水平(1.22±0.16)顯著高于TC組(0.80±0.08，P<0.05)。見圖1。

圖1 小鼠海馬區(qū)NEP等蛋白相對表達水平

2.3各組海馬區(qū)Aβ40和Aβ42濃度 TE組海馬區(qū)Aβ42濃度〔(78.49±8.45)ng/ml〕顯著低于TC組〔(99.74±10.21)ng/ml，P<0.01〕。TE組海馬區(qū)Aβ40質量濃度〔(693.45±309.10)ng/ml〕顯著低與TC組〔(993.87±68.56)ng/ml,P<0.05〕。

3 討 論

“Aβ學說”認為細胞外異常聚集的Aβ是AD主要致病因素和中心環(huán)節(jié)，因此減少腦內(nèi)Aβ的異常聚集是預防AD的關鍵所在〔12〕。本實驗結果表明12 w中等強度的運動干預能夠有效降低海馬區(qū)Aβ42和Aβ40濃度。研究發(fā)現(xiàn)，6 w無刺激的跑臺運動顯著降低Tg APP/PS1小鼠海馬區(qū)Aβ40和Aβ42濃度〔13〕。也有研究證實，對Tg2576小鼠進行長期的運動干預后發(fā)現(xiàn)，運動組海馬區(qū)Aβ42濃度較安靜組顯著下降〔14〕。由此可見，長期中等強度的跑臺運動能夠有效降低AD小鼠海馬區(qū)Aβ40和Aβ42濃度，達到運動預防和延緩AD的目的。

Aβ是AD的主要病理標志之一，Aβ主要是由BACE-1和PS1切割APP蛋白生成的〔2〕。因此，降低APP、BACE-1和PS1的含量對減少Aβ生成十分重要。Tg APP/PS1小鼠因海馬神經(jīng)元過表達APP和PS1基因，導致腦內(nèi)Aβ生成持續(xù)增加，6～7月齡小鼠腦內(nèi)Aβ生成增多〔15〕。本實驗證實，長時間中等強度的運動能夠通過抑制APP和PS1蛋白相對表達水平，減少Aβ生成。研究證實，5個月的跑臺運動顯著降低Tg APP/PS1小鼠海馬區(qū)APP的磷酸化水平和PS1蛋白相對表達水平〔16〕。上述研究結果提示，長期中等強度的運動可能通過抑制APP和PS1蛋白相對表達水平抑制Aβ的生成。

腦內(nèi)Aβ的清除速率慢于Aβ的生成時，Aβ異常聚集加快，誘發(fā)AD〔17〕。腦內(nèi)Aβ清除能力下降是遲發(fā)型AD的主要病因。因此，加速Aβ的清除能夠有效延緩AD的病理進程。運動可以提高Aβ降解酶NEP活性加速海馬區(qū)Aβ的清除〔18〕。而5個月的自主跑輪運動顯著提高Tg APP/PS1小鼠海馬區(qū)NEP的活性〔19〕。由此可見，長期的跑臺(或跑輪)運動可以通過增強NEP的活性降低Tg APP小鼠海馬Aβ濃度，推測可能是運動增加Tg APP小鼠海馬區(qū)NEP蛋白相對表達水平和NEP的活性，加速了Aβ降解，但具體的分子機制還需進一步證實。

腦內(nèi)Aβ的清除主要依靠降解酶和跨血腦屏障兩種途徑，降解酶系統(tǒng)僅能清除少量的Aβ，而跨血腦屏障(BBB)轉運清除途徑能夠清除腦內(nèi)大部分的Aβ〔20〕,提高Aβ的外流速率可以有效降低腦內(nèi)Aβ的含量〔21〕。LRP-1是Aβ由腦內(nèi)運至外周組織的主要載體，其功能異常降低Aβ的外流速率〔22〕。而RAGE則是Aβ通過BBB進入腦實質的功能載體〔22〕。本研究結果提示，跑臺運動能夠降低Tg APP/PS1小鼠海馬區(qū)RAGE蛋白相對表達水平，降低外周血液Aβ的入腦速率。對側腦室注射Aβ25～35導致AD小鼠進行12 d的自主跑輪運動后發(fā)現(xiàn)，運動組海馬區(qū)RAGE蛋白相對表達水平顯著降低〔23〕。也有研究證實，長期中等強度的跑臺干預對Tg APP/PS1小鼠海馬區(qū)RAGE蛋白相對表達水平?jīng)]有產(chǎn)生影響〔16〕。導致上述研究結果不一致的原因可能是采用的實驗動物模型不同導致的。Tg APP/PS1小鼠病理特征主要以海馬區(qū)Aβ生成增多為主，隨著病理進程的不斷發(fā)展，海馬區(qū)纖維狀Aβ數(shù)量和老年斑沉積水平逐漸增多〔24〕。而側腦室注射Aβ25～35導致的AD小鼠，主要表現(xiàn)為海馬區(qū)Aβ濃度較野生型小鼠高，海馬區(qū)纖維狀Aβ數(shù)量和老年斑沉積水平均少于Tg APP/PS1小鼠。另外，Tg APP/PS1小鼠海馬區(qū)Aβ濃度的增加是隨著小鼠月齡的增長而緩慢增長的，而側腦室注射Aβ25～35導致的AD小鼠，海馬區(qū)Aβ濃度在短時間急劇增加，短時間急劇增加的Aβ可能導致機體應激反應，引起機體的生理變化和部分功能蛋白相對表達水平的改變。此外，不同的訓練方式可能也是引起上述實驗結果不同的原因所在，相對于自主跑輪運動，跑臺運動的強度較大，雖然自主跑輪運動強度小于跑臺運動，但對實驗動物而言，自主運動帶來的外界刺激遠遠小于跑臺運動〔25〕。

本實驗推測，運動可能通過上調(diào)海馬區(qū)LRP-1蛋白相對表達水平，下調(diào)了RAGE蛋白相對表達水平，提高了Aβ跨BBB轉運清除速率。研究結果證實〔16〕，對4月齡Tg APP/PS1小鼠進行10 w的跑臺運動后發(fā)現(xiàn)，運動組海馬區(qū)LRP-1蛋白相對表達水平顯著高于安靜組小鼠，提示中等強度的跑臺運動通過提高Tg APP/PS1小鼠Aβ外轉蛋白相對表達水平，降低Aβ內(nèi)轉蛋白相對表達水平，加速 Aβ跨BBB轉運清除速率。

綜上，推測長期中等強度的跑臺運動通過減少海馬區(qū)Aβ的生成、提高Aβ的降解和加速Aβ跨血腦屏障轉運清除速率3條途徑，達到降低海馬Aβ質量濃度，延緩AD的病理進程的目的。