胡康 羅清 朱曉峰 程曉明 馮國麗 劉正蕓 孫素紅

(遵義醫(yī)學(xué)院 1附屬醫(yī)院甲乳外科，貴州 遵義 563000；2附屬醫(yī)院腫瘤研究室；3醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心)

乳腺癌是全球女性腫瘤死亡率最高的癌癥之一。目前手術(shù)切除、放療、化療、放療及分子靶向治療等是針對乳腺癌治療的主要手段〔1〕。在這些診療手段中，臨床發(fā)現(xiàn)部分藥物有明顯的毒副作用，且患者易對其產(chǎn)生耐藥性〔2〕。特異富含AT序列結(jié)合蛋白(SATB)-1是一種組織特異性核基質(zhì)結(jié)合蛋白，在乳腺癌病理切片及乳腺癌細胞株中均可以檢測到SATB-1過表達，提示SATB-1可能是乳腺細胞癌變的關(guān)鍵蛋白，在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中起到?jīng)Q定性作用〔3〕。Kohwi-Shigematsu等〔4〕在檢測相關(guān)基因圖譜發(fā)現(xiàn)，SATB-1可以通過調(diào)節(jié)近1 000個基因來促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，提示其在乳腺癌發(fā)生的不同階段起到重要作用。前期研究篩選發(fā)現(xiàn)茯苓中多糖類成分具有抑制MDA-MB-231細胞遷移作用。茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf屬于為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，傳統(tǒng)上用于治療水腫尿少，痰飲眩悸，脾虛食少，便溏泄瀉，心神不安，驚悸失眠，在《本草正》《本草綱目》和《神農(nóng)本草經(jīng)》均有相關(guān)記載〔5〕。研究顯示，茯苓的主要化學(xué)成分為多糖類化合物，其包括茯苓糖、β-茯苓聚糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、硬烷和纖維素等〔6〕。本實驗探索茯苓多糖(PPS)抑制MDA-MB-231細胞遷移活性，并分析其對SATB-1基因調(diào)控的作用機制及潛在的抗癌藥用價值。

1 材料和儀器

1.1材料 茯苓5.0 kg(產(chǎn)地安徽)購自上海康橋中藥飲片有限公司，陰離子交換樹脂(DEAE Sepharose Fast Flow)和分子篩凝膠柱(Superdex-75)購自GE Healthcare；普魯蘭多糖P-82標(biāo)準品套裝購自Shodex；單糖標(biāo)準品和三氟乙酸(TFA)購自西格瑪公司，氯化鈉和乙醇購自國藥集團；其他試劑均為分析純。人乳腺癌MDA-MB-231細胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，L-15 培養(yǎng)基購自Hyclone公司，TRIzol購自Invitrogen公司，Transwell小室購自康寧，細胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8購自寶生物，胰酶和胎牛血清購自Gibco公司。

1.2儀器 高效液相色譜儀(HPLC)為安捷倫1100系列，配備示差折光檢測器(RI)；GC/MS色譜儀為安捷倫7890B型GC/7693型三重四級桿質(zhì)譜儀(GC-TQTMMS)，TRACE TR-5毛細管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)購自賽默飛公司；多糖分離系統(tǒng)配置RI檢測器購自利穗科技；電子天平購自賽托利斯；冷凍干燥機購自LABCONCO；酶標(biāo)儀購自Molecular Device，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀為ABI7900系列購自美國ABI。

1.3PPS提取及分離純化 PPS的提取和分離過程參見本課題組已發(fā)表文獻〔7〕，活性最強洗脫組分PPS10經(jīng)Superdex75分子篩凝膠柱層析，得PPS10-2。

1.4多糖純度和相對分子量測定 參考文獻〔7〕方法，采用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)法測定低聚糖的純度及相對分子量。

1.5單糖組成分析 參考文獻〔8〕方法，采用還原水解法進行糖組成分析。

1.6細胞活力檢測 人乳腺癌MDA-MB-231細胞株用含有10%胎牛血清(FBS)的L-15培養(yǎng)基在37℃含5% CO2的培養(yǎng)條件下正常培養(yǎng)。待細胞達到90%融合時，按5×104/孔的細胞密度接種于96孔板，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的茯苓樣品處理20 h，然后用CCK-8于490 nm處測量吸光度并計算細胞活力。

1.7細胞遷移實驗 人乳腺癌MDA-MB-231細胞株用含有10% FBS的L-15培養(yǎng)基在37℃含5% CO2的培養(yǎng)條件下正常培養(yǎng)。待細胞達到90%融合時，消化細胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗一次，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)，在transwell各孔上室分別加入200 μl細胞懸液，其細胞密度為1.5×105/孔。在下室加入500 μl含10%FBS的培養(yǎng)基后，將小室置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20 h。取出transwell小室，用PBS緩慢洗滌3次，用甲醇固定10 min后隨即用2%結(jié)晶紫染色15 min，在鏡下觀察時隨機選取5個高倍鏡下視野進行拍照和計數(shù)。

1.8SATB-1基因表達實驗 人乳腺癌MDA-MB-231細胞株用含有10% FBS的L-15培養(yǎng)基在37℃含5% CO2的培養(yǎng)條件下正常培養(yǎng)。待細胞達到90%融合時，消化細胞并將其按照2×105/孔密度接種于12孔板，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的茯苓樣品處理20 h，用TRIzol法提取總RNA，然后用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測SATB-1基因表達。引物設(shè)計序列為：SATB-1正義：AACGAGCAGGAATCTCCCAGGCG；反義：ACCAGTGGGTACGCGATGA。 GAPDH正義：GATGAGATTGGCATGGCTTT；反義：CAGAAGTGGGGTGGCTT。

1.9統(tǒng)計方法 采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1PPS對MDA-MB-231細胞活力的影響 不同濃度PPS處理MDA-MB-231人乳腺癌細胞株24 h后，細胞活力〔(104.0±3.8)%、(106.0±3.6)%、(109.4±6.2)%〕沒有受到影響(P>0.05)，空白對照組細胞活力為〔(100.0±3.0)%〕；表明PPS在50，100和200 mg/L沒有明顯細胞毒性。

2.2PPS對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響 100和200 mg/L的PPS處理細胞20 h后，對MDA-MB-231細胞遷移均有較強的抑制作用，每視野細胞遷移數(shù)分別為(54±21)、(46±7)個，與空白對照組〔(377±79)個〕差異顯著(P<0.05)。見圖1。

圖1 PPS對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.3PPS的分離純化 茯苓樣品經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow分別以H2O、0.1、0.2、0.5和1.0 mmol/L NaCl洗脫分離后，被依次分為5個部分PPSW、PPS1、PPS2、PPS5和PPS10；活性跟蹤檢測獲得最強部位PPS10，再經(jīng)Superdex75純化，獲得多糖PPS10-2。

2.4PPS10-2的純度和分子量測定 PPS-10-2的HPGPC呈單一峰(圖2)，表明PPS10-2為均一多糖。經(jīng)HPGPC法檢測和Cirrus GPC軟件分析測得PPS10-2相對平均分子量為5 761 D。

2.5單糖組成分析 PPS10-2主要含鼠李糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖=10∶3.3∶7.0(圖3)。

2.6PPS10-2對MDA-MB-231細胞活力的影響 不同濃度(50，100，200 mg/L)PPS10-2處理24 h后，細胞活力〔(112.3±3.9)%、(105.5±3.9)%、(102.7±3.7)%〕沒有受到影響(P>0.05)，空白對照組為(100.0%±6.1%)；表明PPS10-2在50，100和200 mg/L不同濃度下對MDA-MB-231細胞無毒性。

圖2 PPS10-2的HPGCP圖譜

A.PPS10-2；B．單糖混合對照品，1．D-鼠李糖，2.L-巖藻糖，3.D-阿拉伯糖，4.D-木糖，5.D-甘露糖，6.D-葡萄糖，7.D-半乳糖圖3 PPS10-2單糖組成分析氣相色譜

2.7PPS10-2對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響 細胞處理20 h后，100 mg/L PPS10-2對MDA-MB-231細胞遷移〔每視野遷移細胞數(shù)為(55±8)個〕均有較強的抑制作用，與空白對照組〔(303±15)個〕差異顯著(P<0.05)(圖4)。

2.8PPS10-2對SATB-1基因的調(diào)控 經(jīng)100 mg/L的PPS10-2處理細胞20 h后對SATB-1抑制作用明顯，SATB-1表達量為0.6，空白對照組為1.0，兩組差異顯著(P<0.05)。表明PPS10-2可能是通過抑制SATB-1基因來抑制MDA-MB-231細胞遷移。

圖4 PPS10-2對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

3 討 論

SATB-1是一種組織特異性表達的核基質(zhì)序列特異性結(jié)合蛋白，與腫瘤的侵襲遷移密切相關(guān)。通過調(diào)控SATB-1可以對腫瘤相關(guān)目標(biāo)基因進行調(diào)控，從而進一步調(diào)節(jié)細胞分化和凋亡，從而影響腫瘤細胞的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。SATB-1在乳腺癌患者組織中有高表達，然而在正常組織中沒有表達〔9，10〕。敲除SATB-1基因后可以發(fā)現(xiàn)其可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌癌細胞的表型，對于腫瘤的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。乳腺癌中SATB-1可以通過直接上調(diào)腫瘤相關(guān)基因和下調(diào)腫瘤抑制基因從而對腫瘤的發(fā)生，轉(zhuǎn)移及預(yù)后起宏觀調(diào)控的作用〔4，11〕。多種基因可以參與和調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移機制，這一復(fù)雜過程主要包括原發(fā)灶分離、浸潤血管和淋巴及內(nèi)皮細胞黏附、分解基質(zhì)、外滲，導(dǎo)致血管生成并逃避抗腫瘤免疫應(yīng)答，最終在轉(zhuǎn)移部位生長〔12～14〕。本實驗結(jié)果表明PPS和PPS10-2在檢測的最高濃度200 mg/L時對細胞沒有明顯的毒性作用。其次，在處理高侵襲性乳腺癌細胞MDA-MB-231后，乳腺癌細胞的遷移被顯著抑制，結(jié)果顯示PPS和均一多糖PPS10-2能顯著降低其體外遷移的能力。PPS及均一多糖PPS10-2可能是通過抑制SATB-1來降低MDA-MB-231細胞的體外遷移能力，由此闡明PPS中可能是均一多糖PPS10-2成分通過下調(diào)SATB-1來抑制MDA-MB-231細胞遷移作用，從而抑制乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。