鄭帥 楊敏 王家平 楊揚 白彝華

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1腎臟內(nèi)科,云南 昆明 650101;2放射科)

糖尿病腎病(DKD)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一〔1〕，其病變主要累及腎臟小血管和腎小球，引起蛋白尿排泄和濾過異常，已成為終末期腎病(ESRD)的主要發(fā)病原因〔2〕。目前，針對DKD的治療手段及療效均有限，因此對于DKD的治療已經(jīng)成為全世界的難題。間充質(zhì)干細胞(MSCs)來源于中胚層，是一種具有自我復(fù)制更新能力及多向分化潛能的多能干細胞。同時，MSCs體外培養(yǎng)條件不高，可不斷傳代，具有抗氧化應(yīng)激、抗纖維化和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等多效性，使干細胞移植成為治療糖尿病及其并發(fā)癥的研究方向，尤其是治療多誘因?qū)е碌腄KD的研究熱點〔3〕。研究表明〔4〕，MSCs靜脈給藥后1型糖尿病小鼠不僅改善了血糖水平，而且表現(xiàn)出更好的腎臟組織學(xué)特征，并抑制炎癥因子的表達和DKD纖維化。提示MSCs是治療DKD的一種可行的手段?；|(zhì)細胞衍生因子(SDF)-1，又名CXCL12，是骨髓基質(zhì)細胞產(chǎn)生的一種趨化蛋白〔5〕。在各個組織中，SDF-1呈現(xiàn)不同的作用，在慢性腎損傷中，損傷腎組織局部高表達SDF-1能夠誘導(dǎo)MSCs沿濃度梯度遷移至損傷部位并實現(xiàn)歸巢，從而修復(fù)損傷部位。在腎損傷的微環(huán)境中，經(jīng)SDF-1轉(zhuǎn)染能否利于MSCs遷移到損傷部位并對損傷部位起修復(fù)作用，尚不可知。本研究擬探索SDF-1轉(zhuǎn)染對MSCs的影響。

1 材料和方法

1.1材料 小鼠足細胞MPC5購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，SDF-1α腺病毒購自上海吉凱基因公司，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒及Western印跡試劑盒購自武漢華美生物公司。提取骨髓MSC的C57BL/6小鼠購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心〔SCXK(蘇)2012-0004〕。

1.2分組 首先通過高糖培養(yǎng)小鼠足細胞系MPC5來構(gòu)建足細胞受損模型。構(gòu)建模型成功后將細胞分為3組，空白對照組：高糖(30 mmol/L)誘導(dǎo)凋亡損傷的腎小球足細胞培養(yǎng)組；MSC組：MSCs與高糖誘導(dǎo)凋亡腎小球足細胞聯(lián)合培養(yǎng)組；MSC-SDF-1組：經(jīng)SDF-1轉(zhuǎn)染的MSCs與高糖誘導(dǎo)凋亡的腎小球足細胞聯(lián)合培養(yǎng)組。

1.3MSC的分離及培養(yǎng) 取小鼠臍帶組織，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，用眼科剪將組織標(biāo)本剪碎；將臍帶轉(zhuǎn)移至細胞分離管中，加入培養(yǎng)基后，組織分離器攪拌3次，45 s/次。 然后將組織轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中加入適量PBS，1 000 r/min離心15 min，棄上清，再加入PBS重復(fù)洗滌 3次，加培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%以上，收集細胞并傳代，傳至第3代時，進行后續(xù)試驗。

1.4SDF-1的細胞轉(zhuǎn)染 將P3代MSC以2×105密度接種于6孔板，MSC組加入完全培養(yǎng)基；MSC-SDF-1組以感染復(fù)數(shù)為40的SDF-1α腺病毒溶于無血清培養(yǎng)基感染MSC，轉(zhuǎn)染6 h后棄去含有腺病毒的無血清培養(yǎng)基，新加完全培養(yǎng)基。于37℃、5% CO2、20% O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。倒置熒光顯微鏡下觀察腺病毒轉(zhuǎn)染效果，并采用Western印跡法檢測SDF-1表達。

1.5Transwell細胞遷移實驗 選取8 μm孔徑濾膜的Transwell細胞板，每組分別取0.2 ml細胞懸液加入Transwell細胞板的上室。下室中加入500 μl 100 μg/L的SDF-1α蛋白無血清培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2、20%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取出上室，棉簽擦拭濾膜上部未穿膜遷移細胞后PBS洗滌。多聚甲醛固定穿膜細胞20 min后結(jié)晶紫染色，10 min后洗去，用棉簽擦去小室上層未遷移的細胞，各取6個視野顯微鏡下觀察拍照，計算并求平均值。觀察并拍照后分別用0.4 ml 33%冰醋酸溶解已染色細胞內(nèi)的結(jié)晶紫，用酶標(biāo)儀于565 nm波長下檢測各組光密度。

1.6Western印跡檢測 移除培養(yǎng)基，PBS洗滌后收集細胞，加入蛋白裂解液，0℃裂解30 min，12 000 r/min離心15 min后，取上清，二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。上清加入蛋白上樣緩沖液于100℃變性5 min。配置10%分離膠及濃縮膠，每孔加入30 μg蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。200 mA恒流電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。脫脂奶粉配置5%封閉液，封閉60 min，以β-actin蛋白為內(nèi)參，分別加入β-actin、SDF-1、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(casepase)-3抗體，4℃封閉過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫孵育60 min。洗膜，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒反應(yīng)后拍照。樣本灰度值的相對表達量采用ImageJ軟件進行分析。

1.7細胞中總RNA提取 收集共培養(yǎng)48 h后的MPC-5細胞，加入1 ml RNAiso Plus溶液(Takara 9109)，室溫孵育10 min，充分裂解細胞。收集細胞裂解液入1.5 ml離心管中，加入200 μl氯仿，振蕩，室溫靜置5 min。13 000 r/min，4℃離心15 min。吸取離心好的上清，并轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積異丙醇500 μl。充分混勻，冰上放置30 min。13 000 r/min，4℃離心10 min。小心棄上清，可見管底有白色沉淀。加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇。7 500 r/min，4℃離心5 min。棄上清，倒立離心管于吸水紙上，超凈工作臺中晾干后，加入20 μl焦碳酸二乙酯水溶解沉淀，即為總RNA樣品。

1.8RNA逆轉(zhuǎn)錄 冰上配置如下體系：5×gDNA Eraser緩沖液2.0 μl，gDNA Eraser 1.0 μl，Total RNA 1～7 μl，RNase Free dH2O至10 μl。將如上反應(yīng)體系于42℃處理2 min，保存于4℃。向反應(yīng)體系中加入如下試劑：Reaction solution from step 1 10.0 μl,5×PrimeScript緩沖液(用于實時定量PCR) 4.0 μl,PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μl,RT Primer Mix 1.0 μl,RNase Free dH2O至20 μl。將反應(yīng)體系于37℃處理15 min，然后85℃處理5 s，然后保存于4℃。

1.9實時定量PCR檢測各基因的表達 GAPDH引物：正義：5′-TGGAATCCACTGGCGTCT-3′,反義：5′-GGTTCACGCCCATCACAAAC-3′,胰島素樣生長因子(IGF)-1 引物：正義：5′-CGAGGGGCTTTTACTTCAAC-3′,反義：5′-GGCTGCTTTTGTAGGCTTC-3′；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β引物：正義：5′-CGAAGCGGACTACTATGCTA-3′,反義：5′-GAATGTCTGACGTATTGAAGAA-3′。采用如下反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 10 μl，Primer Mix 1 μl(各10 μmol/L),ROX reference dyeⅡ 0.4 μl,cDNA 2 μl,Sterilized H2O至20 μl。PCR條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)，進行實時PCR檢測。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1細胞損傷模型建立 經(jīng)過高糖誘導(dǎo)后，caspase-3蛋白酶表達增加，見圖1。說明細胞損傷模型建立成功。

2.2MSCs的轉(zhuǎn)染 MSC-SDF-1組經(jīng)轉(zhuǎn)染的MSCs中過表達SDF-1，并且表達效率高，見圖2。說明SDF-1轉(zhuǎn)染MSCs成功。

2.3各組穿過Transwell膜的細胞數(shù) MPC-5組穿過Transwell膜的細胞數(shù)為0，MSC+MPC-5組遷移細胞數(shù)為(93±14)個，MSC+SDF-1+MPC-5組遷移細胞數(shù)為(182±24)個，各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 高糖誘導(dǎo)前后caspase-3蛋白酶的表達

圖2 各組細胞培養(yǎng)中SDF-1表達

圖3 各組細胞遷移情況及細胞遷移數(shù)量(結(jié)晶紫染色，×200)

2.4各組IGF-1、TGF-β的表達 與空白對照組(均為1.00±0.00)比較，MSC組IGF-1(0.25±0.13)和TGF-β含量(0.24±0.08)顯著降低(P<0.05)，而MSC+SDF-1組較MSC組IGF-1(0.04±0.03)和TGF-β含量(0.07±0.06)顯著降低(均P<0.05)。

2.5各組caspase-3表達 MSC組、MSC-SDF-1組caspase-3含量(0.50±0.06，0.20±0.04)顯著低于空白對照組(1.20±0.11，均P<0.05);而MSC+SDF-1組中caspase-3的含量較MSC組明顯下降(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組caspase-3蛋白酶表達

3 討 論

DKD是導(dǎo)致ESRD的重要原因〔6〕。在復(fù)雜的生理病理過程中，腎臟的足細胞受損在DKD中發(fā)揮重要的作用。因此，若能修復(fù)受損足細胞，則減輕了大量蛋白尿的產(chǎn)生，延緩DKD患者腎功能惡化的進展。高糖培養(yǎng)MPC-5細胞是經(jīng)典的體外DKD模型，是研究DKD誘導(dǎo)足細胞損傷的理想方法。

MSCs是在骨髓基質(zhì)中分離的非造血細胞，由Friendstein等〔7〕在1967成功分離并培養(yǎng)。它在一定條件下可以自我更新并分化為多種功能性細胞。相關(guān)研究提示，MSCs的作用主要是通過抗凋亡、抗炎因子、細胞保護作用及細胞分化介導(dǎo)的〔8,9〕。當(dāng)一定數(shù)量的MSCs注入后，便會種植在受損的細胞表面，并且這些細胞能夠通過分泌細胞因子和體液因素〔如血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、IGF〕，創(chuàng)造一個適宜的微環(huán)境。已證實MSCs對受損腎小管細胞及血管內(nèi)皮細胞均有修復(fù)作用〔10，11〕。這支持了MSCs有可能參與腎臟組織的修復(fù)和再生。但目前應(yīng)用MSCs移植后歸巢數(shù)量不足。而SDF-1與MSCs的定向遷移和成血管能力密切相關(guān)。SDF-1是趨化因子中的一種小型分泌蛋白，與相關(guān)受體結(jié)合后可參與干細胞歸巢、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等眾多機體活動中，并發(fā)揮重要作用。本實驗結(jié)果提示SDF-1轉(zhuǎn)染使MSCs更容易遷移至受損足細胞側(cè)?？赡芘cSDF-1可通過趨化、黏附、捕獲等方式促進MSCs遷移至受損的足細胞側(cè)有關(guān)〔12〕。推測通過轉(zhuǎn)染SDF-1，使得MSCs遷移至損傷足細胞側(cè)并起到修復(fù)作用成為可能。

本實驗發(fā)現(xiàn)，與MSCs共培養(yǎng)能夠抑制IGF-1和TGF-β的表達?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，DKD的主要影響因素有糖代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。相關(guān)研究表明〔13,14〕，MSCs干預(yù)后可改善腎小球纖維化的病理異常。IGF主要通過自分泌和旁分泌對細胞組織的增殖、分化、凋亡和機體的生長發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用，是體內(nèi)一類具有多功能的細胞增殖調(diào)控因子。IGF主要通過特殊的IGF-1受體來完成代謝，IGF-1通過激活細胞信號傳導(dǎo)通路來激活基因的表達。胰島素水平等因素影響著IGF-1的合成，IGF-1廣泛存在于腎臟中〔15〕。在DKD中，高血糖致腎小球系膜細胞缺氧損傷，導(dǎo)致腎臟局部IGF-1旁分泌合成代償增高，同時降解減少，最終導(dǎo)致IGF-1增高，與此同時，IGF-1使細胞外基質(zhì)成分堆積加速腎小球硬化〔16〕。Bach等〔17〕發(fā)現(xiàn)在鏈脲佐菌素(STZ)誘發(fā)的DKD大鼠腎臟內(nèi)IGF-1的增加，提示IGF是引起DKD高濾過的主要原因之一。TGF-β被認為是腎小管間質(zhì)纖維化形成與發(fā)展的關(guān)鍵因子，在腎臟纖維化的發(fā)病機制中起著重要的調(diào)控作用〔18〕，并能在刺激上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)生成的同時又抑制其降解，促進腎纖維化形成〔19〕，因此TGF-β是誘導(dǎo)DKD腎臟纖維化的重要介質(zhì)。而TGF-β有多種亞型，其中TGF-β1又與纖維化的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系最為密切。TGF-β糖尿病大鼠中TGF-β1的表達顯著升高，MSCs治療DKD過程中TGF-β1的表達下降，并提高了緊密結(jié)合蛋白的表達，從而抑制上皮細胞-間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)換，遏制蛋白尿和纖維化的繼續(xù)惡化〔4〕。本實驗說明經(jīng)SDF-1轉(zhuǎn)染能提高MSCs修復(fù)足細胞損傷的能力。此外，本研究通過MSCs治療后可使caspase-3蛋白酶含量明顯減少，已知細胞凋亡是通過caspase-3蛋白酶誘導(dǎo)產(chǎn)生的〔20〕，表明MSCs能夠延緩足細胞的凋亡，并且通過SDF-1轉(zhuǎn)染后MSCs這種抑制足細胞凋亡的作用更加明顯，與文獻報道經(jīng)MSCs治療后可顯著抑制caspase-3激活，減少細胞死亡的結(jié)論一致〔21〕。

綜上，在體外實驗中，證實了MSCs能夠下調(diào)足細胞中IGF-1和TGF-β的表達。通過SDF-1轉(zhuǎn)染的MSCs不僅能夠更高效地遷移至受損足細胞側(cè)，且對損傷足細胞起到更顯著的修復(fù)作用。