朱春璐 王 靜 喬宇航 謝鑫榮 袁子民

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600

白芷具有解表散寒，祛風(fēng)止痛等功效。古代白芷的炮制品有醋炒、酒炒、酒浸、蒸制、酒蒸等多種炮制方法，其酒制后可增強(qiáng)白芷祛風(fēng)散寒、消腫排膿作用[1]。都梁丸收載于2015版《中國藥典》，用于風(fēng)寒瘀血阻滯脈絡(luò)所致的頭痛，該方君藥為酒燉白芷[2]，其炮制目的及對藥效成分的影響研究甚少，文獻(xiàn)報(bào)道[3-6]白芷中總香豆素、氧化前胡素、歐前胡素、8-甲氧基異歐前胡內(nèi)酯及異歐前胡素具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解痙等藥理作用。因此，本文建立了酒燉白芷中總香豆素及4種香豆素含量測定方法，并比較酒燉前后對其藥效成分的影響，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及炮制機(jī)理的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

U-3010紫外可見分光光度計(jì)(日本日立公司)； Agilent1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；KQ3200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。白芷三批(祁白芷，河北安國)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch．ex Hoffm.)Benth.et Hook．f．的干燥根；氧化前胡素、8-甲氧基異歐前胡內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素對照品均購于上海源葉生物科技有限公司，HPLC檢測純度均≥98%；甲醇為色譜純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒燉白芷的制備 取藥材除去雜質(zhì)，大小分開，略浸，潤透，切厚片，干燥，得白芷飲片。取白芷飲片，加入黃酒(每100 Kg白芷加入黃酒20 Kg)，悶潤時(shí)間為0.5 h，隔水蒸制時(shí)間為5 h，干燥，即得。

2.2 總香豆素的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取歐前胡素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成19.2 μg·mL-1對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 分別取白芷、酒燉白芷粉末(過20目篩)約0.2 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 KHz)1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

2.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取2.2.1項(xiàng)下的對照品溶液1.0、2.0、4.0、5.0、10.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成系列濃度對照品溶液，以甲醇為空白，在300 nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.0443x+0.0096(r=0.9994)。結(jié)果歐前胡素濃度在1.92～19.20 μg·mL-1內(nèi)線性良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，以甲醇為空白，在300 nm波長處測定吸光度，重復(fù)6次，結(jié)果RSD為1.02%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一酒燉白芷飲片樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，以甲醇為空白，分別在300 nm波長處測定吸光度，計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為1.58%，RSD為1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一酒燉供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h以甲醇為空白，在300 nm波長處測定吸光度，結(jié)果RSD為1.25%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 分別取已知含量的同一酒燉白芷飲片粉末(總香豆素含量為1.60%)0.1 g，精密稱定，各6份，分別精密加入歐前胡素對照品溶液(濃度為192 μg·mL-1)8.0 mL，再精密加入甲醇17.0 mL，其余按“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液。依法測定，計(jì)算回收率，結(jié)果回收率在96.2%～99.4%之間，平均回收率為97.2%，RSD為1.3%，符合相關(guān)規(guī)定。

2.2.8 樣品含量測定 取3批白芷及其炮制的酒燉白芷樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依法測定，計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

2.3 4種香豆素的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(70∶30)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：300 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖1。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 分別取4種香豆素對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含歐前胡素0.8 mg、8-甲氧基異歐前胡內(nèi)酯0.82 mg、異歐前胡素0.85 mg、氧化前胡素0.65 mg的對照品溶液備用。分別精密量取歐前胡素、氧化前胡素對照品溶液各2.0 mL及8-甲氧基異歐前胡內(nèi)酯、異歐前胡素對品溶液各1.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 分別取白芷、酒燉白芷粉末(過20目篩)約0.2 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 KHz)1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，分別取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取上述“2.3.2”項(xiàng)下的混合對照品溶液0.10、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1，各成分線性關(guān)系良好。

表1 回歸方程及線性范圍

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取同一酒燉供試品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果4種香豆素峰面積的RSD分別為1.4%、1.6%、1.8%、1.3%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取同一酒燉供試品溶液，分別在0、2、4、6、8 h，測定峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果4種香豆素峰面積的RSD分別為1.3%、1.5%、1.8%、1.9%，表明8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一酒燉樣品各6份，按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并依法測定并計(jì)算RSD，結(jié)果4種香豆素含量的RSD分別為1.2%、1.6%、1.4%、1.7%，表明重復(fù)性良好。

2.3.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的酒燉白芷粉末約0.1 g，精密稱定，平行6份，分別按樣品含量加入4種香豆素對照品溶液適量，按2.3.3項(xiàng)下制備供試品溶液，測定含量，結(jié)果4種香豆素的平均回收率分別為98.4%、99.2%、97.0%、97.2%，RSD分別為1.8%、1.7%、2.3%、2.3%，表明回收率試驗(yàn)良好，符合有關(guān)規(guī)定。

2.3.9 樣品含量測定 取3批白芷及其炮制的酒燉白芷，按2.3.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依法測定，計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 白芷及酒燉白芷的含量測定結(jié)果 (%，n=3)

3 討論

將4種香豆素類對照品溶液、供試品溶液分別在200～400 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果均在300 nm處有最大吸收，因此選擇300 nm作為總香豆素及4種香豆素類成分含量測定的波長。本實(shí)驗(yàn)采用等度洗脫，4種香豆素類成分均能達(dá)到較好的分離，便于測定。

有文獻(xiàn)研究表明川白芷樣品熏硫前后多種香豆素類成分的含量有較大損失[7]，表明香豆素類成分穩(wěn)定性較差。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)酒燉(隔水蒸制)炮制后總香豆素含量增加，但4種香豆素類成分含量均有所下降，可能與黃酒的弱酸性、受熱及蒸汽中水的作用下使成分轉(zhuǎn)化有關(guān)[8-9]；但總香豆素含量增加，可能與新的香豆素類成分的產(chǎn)生及轉(zhuǎn)化成其他成分后紫外吸收增強(qiáng)有關(guān)；另外，由于成分含量的變化，可能對藥效作用產(chǎn)生改變，這與都梁丸中白芷采用酒燉炮制后入藥，增強(qiáng)治療偏頭痛藥效是否一致，還需進(jìn)一步深入研究。