宋 爽 ，劉 宇 **，高 琪 ，趙 爽 ，王守現(xiàn) ，宋慶港

（1.北京市農林科學院 植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097；2.北京市食用菌工程技術研究中心，北京 100097；3.農業(yè)部都市農業(yè)（北方）重點實驗室，北京 100097）

DNA甲基化是目前研究較為透徹的表觀遺傳修飾，常發(fā)生在胞嘧啶的第5位碳原子上，在DNA甲基轉移酶的作用下，將S -腺苷甲硫氨酸上甲基轉移到胞嘧啶上[1]。作為一種重要并相對穩(wěn)定的表觀遺傳修飾策略，DNA甲基化通過穩(wěn)定染色質結構、調控基因表達、參與基因重組等方式，在原核生物、動物、植物等多種生物的基本生物學過程中發(fā)揮重要作用[2]。在真菌中，DNA甲基化可能參與形態(tài)建成、逆境脅迫和次級代謝過程，但對其具體功能研究較少。目前，對基因組甲基化水平分析手段主要采用甲基化敏感擴增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技術，利用同尾酶HpaⅡ和MspⅡ對CCGG序列中的胞嘧啶甲基化反應的不同，對基因組范圍內的甲基化狀態(tài)變化進行分析[3]。

根據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計，2017年我國香菇總產量為986.51萬噸，位居所有食用菌品種之首[4]。香菇為中低溫型變溫結實性菇類，菌絲最適生長溫度為24℃～27℃，在生產中如遇到較高的環(huán)境溫度，常會引起菌絲死亡和菌棒腐爛[5]。由于全球變暖，高溫脅迫已經影響到我國許多地區(qū)的農業(yè)生產，因此耐高溫能力成為食用菌抗逆性評價的重要指標，而食用菌抵御高溫脅迫的機制也成為研究熱點。目前，已經有研究報道了香菇受高溫脅迫后生理響應和耐熱相關基因表達變化，但關于香菇高溫條件下基因組表觀遺傳變化還未見報道[5]。本研究利用MSAP技術分析了耐高溫和高溫敏感香菇菌株在熱脅迫處理后基因組DNA甲基化水平和甲基化模式變化，為表觀遺傳修飾在香菇逆境應答中的作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

供試材料為課題組前期篩選的耐熱香菇菌株（JZB2102050）和熱敏感香菇菌株（JZB2102030），由北京市農林科學院植物保護環(huán)境保護研究所保存。

1.1.2 引物與試劑

所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；DNA Marker、DNA聚合酶、限制性內切酶HpaⅡ和MspⅡ， 購自寶生物工程（大連）有限公司；基因組DNA提取試劑盒，購自德國QIAGEN公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng)

利用打孔器將活化好的香菇JZB2102050和JZB2102030菌絲體分別定量接種在PDA培養(yǎng)基中心，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，繼續(xù)置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，刮取100 mg的菌絲，利用試劑盒提取基因組DNA。25℃恒溫培養(yǎng)9 d的香菇菌絲為對照組。

1.2.2 基因組MSAP分析

雙酶切：分別用各10 U的HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅡ/EcoRⅠ雙酶切400 ng香菇基因組DNA，酶切體系50 μL，37℃酶切12 h。

接頭連接：2條EcoRⅠ接頭和HpaⅡ/MspⅡ接頭分別等量混合，95℃變性5 min合成雙鏈接頭。連接體系：雙鏈EcoRⅠ（5 pmol·μ L-1）接頭0.5 μL，雙鏈 HpaⅡ /Msp Ⅱ（5 pmol·μ L-1）接頭 5 μL，酶切產物 12 μL，10×T4連接酶 buffer 2 μL，T4連接酶 0.5 μL，16℃連接過夜。

預擴增：反應體系為連接產物2 μ L，10 × Ex Taq Buffer 5 μ L，dNTP 5 μ L，預擴增引物各 1 μ L，Ex Taq酶0.2 μL，加ddH2O補至50 μL。反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min； 4℃保存。

選擇性擴增：將預擴增產物稀釋50倍后作為選擇性擴增模板，擴增引物序列見表1，共64對。反應體系為稀釋后預擴增產物5 μL，10 × Ex Taq buffer 5 μ L，dNTP 5 μ L，EcoR Ⅰ選擇性擴增引物 1 μ L，HpaⅡ/MspⅡ選擇性擴增引物1 μ L，Ex Taq酶0.2 μ L，ddH2O 補至 50 μ L。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min，10個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度下降1℃；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共25個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：選擇性擴增產物進行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染觀察并拍照。CCGG位點未發(fā)生甲基化，HpaⅡ/EcoRⅠ和MspⅡ/EcoRⅠ酶切均有條帶；Ⅱ型（1，0）表示CCGG位點發(fā)生半甲基化，前者酶切有條帶，后者酶切無條帶；Ⅲ型（0，1）表示CCGG位點發(fā)生全甲基化，前者酶切無條帶，后者酶切有條帶；Ⅳ型（0，0）表示兩者酶切均無條帶，CCGG位點發(fā)生超甲基化。

表1 引物及接頭序列Tab.1 Sequence of primers and adaptors

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫下香菇基因組DNA甲基化水平變化

采用64對選擇性擴增引物對高溫脅迫處理及對照組的香菇JZB2102050和JZB2102030基因組DNA進行MSAP分析，見表2。

表2 高溫脅迫下香菇基因組DNA甲基化水平Tab.2 DNA methylation level of Lentinula edodes after heat stress

由表2可以看出，耐熱菌株和熱敏感菌株對照組DNA甲基化比例分別為24.59%和19.50%，高溫脅迫后甲基化比例分別上升了43.22%和27.03%，全甲基化比例分別上升了26.42%和8.69%，說明高溫可誘導香菇菌株甲基化水平提高，且耐熱菌株甲基化水平變化大于熱敏感菌株。

2.2 高溫對香菇基因組DNA甲基化模式變化的影響

進一步對2個香菇菌株處理組和對照組的擴增條帶帶型變化進行分析，歸納為以下13種帶型，其中A型表示處理組與對照組之間甲基化模式無變化，B型表示處理組發(fā)生甲基化，C型表示處理組發(fā)生去甲基化，見表3。

表3 高溫脅迫下香菇基因組DNA甲基化模式變化Tab.3 Methylation pattern variation of Lentinula edodes after heat stress

由表3可以看出， 擴增條帶最多的帶型為A1（1，1/1，1），即處理組與對照組在該位點未發(fā)生甲基化。在所有甲基化條帶中，耐熱菌株JZB 2102050發(fā)生甲基化和發(fā)生去甲基化條帶比例分別占56.19%和29.20%，熱敏感菌株JZB2102030發(fā)生甲基化和發(fā)生去甲基化條帶比例分別占43.78%和34.56%（見圖1），表明在受到高溫脅迫后，耐熱菌株主要發(fā)生甲基化，而熱敏感菌株主要發(fā)生去甲基化。

圖1 熱敏感菌株JZB2102030發(fā)生甲基化（B5）和去甲基化（C3）位點電泳條帶圖Fig.1 Methylation and demethylation bands of heat-sensitive strain JZB2102030 after heat stress

3 討論

食用菌生長發(fā)育需要適宜的溫度、濕度、營養(yǎng)、光照、pH等條件，在遇到環(huán)境脅迫時，為保持基因組穩(wěn)定，DNA甲基化模式改變?yōu)闀r常發(fā)生的生理反應。植物在脅迫后甲基化變異研究較多，殷歡等[6]研究發(fā)現(xiàn)黃瓜幼苗在高溫脅迫后葉片甲基化水平提高，曾子入等[5]研究發(fā)現(xiàn)熱脅迫后耐熱蘿卜材料主要發(fā)生去甲基化過程，而不耐熱材料發(fā)生超甲基化頻率較高，但在食用菌中關于DNA甲基化在脅迫過程中的響應研究較少。肖冬來等[6]利用F-MSAP技術分析了光照對廣葉繡球菌甲基化的影響，結果表明，光照可誘導全甲基化率上調，半甲基化率下調。藍麗雯等[7]研究發(fā)現(xiàn)，抑制靈芝DNA甲基化可促進靈芝酸的生物合成，這種作用是通過提高靈芝酸合成酶基因的表達來實現(xiàn)的。本研究以香菇耐熱菌株JZB 2102050和熱敏感菌株JZB2102030為材料，研究了菌絲在高溫脅迫前后的DNA甲基化變化，結果顯示，2個香菇菌株在脅迫處理后甲基化水平都表現(xiàn)為上升，但耐熱菌株甲基化水平變化大于熱敏感菌株；香菇在受到高溫脅迫后，甲基化和去甲基化同時發(fā)生，耐熱菌株主要發(fā)生甲基化，而熱敏感菌株主要發(fā)生去甲基化，這對深入研究脅迫環(huán)境下香菇適應性進化提供了一定參考。