孫芳園,許開亮,袁林,孫晶晶,韓耀國,雷鳴,張濤
膿毒癥是機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙,具有較高的死亡風(fēng)險[1]。膿毒癥常常同時存在炎癥反應(yīng)和代償性抗炎反應(yīng)[2]。同時,促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)之間的復(fù)雜相互作用決定膿毒癥的結(jié)果[3]。因此,膿毒癥早期診斷和預(yù)后預(yù)測需要新的生物標(biāo)志物[4]。
肌腱蛋白(Tenascins)是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白,參與多種病理過程如炎癥、組織損傷、腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移[5]。Tenascin-C的持續(xù)高表達(dá)常見于炎癥、組織重塑和自身免疫性疾?。?]。感染和損傷能誘導(dǎo)Tenascin-C表達(dá),促使機(jī)體對細(xì)菌脂多糖(LPS)產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。在小鼠膿毒癥模型中,LPS處理能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞表達(dá)Tenascin-C,并與LPS所誘導(dǎo)的促炎癥細(xì)胞因子有關(guān)[7]。這表明Tenascin-C可能是一種膿毒癥的炎癥促進(jìn)因子。然而,血清Tenascin-C在膿毒癥病人的表達(dá)和臨床意義尚不清楚。
在這項研究中,我們作了一個初步的臨床研究,探討膿毒癥病人血清Tenascin-C濃度和臨床嚴(yán)重程度、病死率與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。我們的研究將提供血清Tenascin-C水平為膿毒癥病人的預(yù)后標(biāo)志物。
1.1 病例設(shè)計選取2016年1月至2017年6月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院普通內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)收治的膿毒癥病人174例,根據(jù)ACCP/SCCM共識會議[8]提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診。膿毒癥被定義為存在微生物學(xué)證實的感染、急性器官衰竭和全身炎癥反應(yīng)綜合征(至少兩個以下參數(shù):①溫度>38或<36 ?C;②心率>90次/分;③呼吸頻率>20次/分或PaCO2<32 mmHg;④血白細(xì)胞(WBC)計數(shù)>12 000或<4 000細(xì)胞/mm3,或>10%不成熟的形式)。感染性休克是膿毒癥合并頑固性低血壓(收縮壓<90 mmHg),需要補(bǔ)液和升壓藥維持血壓。應(yīng)用膿毒癥相關(guān)器官衰竭評估(Sepsis-related Organ Failure Assessment,SOFA)評分來定量估計病人器官損害嚴(yán)重程度。對這些病人實施了標(biāo)準(zhǔn)的膿毒癥治療,包括抗生素、機(jī)械通氣和液體復(fù)蘇。所有病人進(jìn)行監(jiān)測,直到他們從ICU出院或死亡,進(jìn)一步的隨訪至少30 d。同時選取80名性別和年齡相匹配的健康獻(xiàn)血者為健康對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),并按照《赫爾辛基宣言》進(jìn)行。病人或家屬簽署知情同意書。
1.2 數(shù)據(jù)測量記錄所有病人的連續(xù)變量:年齡、SOFA評分、ICU天數(shù)、血清肌酐、乳酸、白細(xì)胞計數(shù)和血小板。所有實驗室數(shù)據(jù)為病人入院24 h內(nèi)抽血測得。記錄所有病人的分類變量:性別、感染部位、呼吸機(jī)應(yīng)用,感染性休克。終點為30 d存活。抽取入住ICU24 h內(nèi)的靜脈血液樣本,4°C離心5 000g×5 min,-80 °C 存儲。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。
1.3 ELISA檢測血清可溶性Tenascin-C按照商業(yè)化試劑盒(Fujioka,日本)的指示測量健康對照組和膿毒癥病人血清Tenascin-C水平[9],用酶標(biāo)儀測量在450 nm吸光度。根據(jù)不同濃度重組人Tenascin-C建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定個病例的血清Tenascin-C濃度。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。連續(xù)變量以中位數(shù)(四分位數(shù))表示,用Mann-Whitney U秩和檢驗進(jìn)行兩獨立樣本的非參數(shù)檢驗。分類變量以頻率(百分比)表示,用χ2檢驗。Tenascin-C與連續(xù)變量之間的相關(guān)性用等級相關(guān)檢驗(Spearman’s rank correlation test)分析。用Logistic多因素回歸模型分析Tenascin-C對病人30 d病死率的獨立貢獻(xiàn),以比值比(odds ratio)和95%置信區(qū)間(CI)表示。制作ROC曲線確定血清Tenascin-C對于存活者和死亡者之間的區(qū)分點。制作Kaplan-Meier曲線分析高血清Tenascin-C水平(≥56.9 ng/L)對膿毒癥病人30 d病死率的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 研究人群在ICU連續(xù)性收治的174例膿毒癥病人中,男性112例,女性62例,中位年齡60歲。隨訪30 d后,死亡60例,病死率34.5%。與存活者相比,死亡組病人具有明顯增高的SOFA評分、血清肌酐、乳酸、CRP、IL-6和TNF-α水平(均P<0.05)。同時,死亡組的感染性休克和呼吸機(jī)使用發(fā)生頻率較高(均P<0.05)。ICU入院時膿毒癥病人的臨床特征見表1。
表1 膿毒癥病人174例臨床特征
2.2 血清Tenascin-C升高與膿毒癥病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析膿毒癥病人血清Tenascin-C水平(中位數(shù)為57.1 ng/L)明顯高于健康對照(中位數(shù)為24.1 ng/L)(P<0.001)(圖1A)。在膿毒癥病人中,死亡組血清Tenascin-C水平(中位數(shù)為64.9 ng/L)明顯高于存活組(中位數(shù)為52.1 ng/L)(P<0.001)(圖1B)。血清Tenascin-C在使用與不使用呼吸機(jī)病人之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1C)。休克病人血清Tenascin-C明顯高于無休克者(圖1D)。
2.3 血清Tenascin-C和臨床變量之間的相關(guān)性我們采用Spearman等級相關(guān)檢驗分析了血清Tenascin-C與連續(xù)變量的相關(guān)性。所有膿毒癥病人血清Tenascin-C與SOFA評分、血清肌酐、CRP、IL-6和TNF-α之間正相關(guān)(均P<0.05)(表2)。
表2 膿毒癥病人血清Tenascin-C與其它定量指標(biāo)的相關(guān)性
圖1 膿毒癥病人和健康對照組的血清Tenascin-C的水平:A為膿毒癥病人(n=174)血清Tenascin-C水平高于健康對照組(n=80)(P<0.001);B為死亡組(n=60)血清Tenascin-C水平高于存活組(n=114);C為使用呼吸機(jī)病人(n=90)血清Tenascin-C水平和不使用呼吸機(jī)病人(n=84)差異無統(tǒng)計學(xué)意義;D為休克者(n=97)血清Tenascin-C水平高于無休克者(n=77)
2.4 高血清Tenascin-C對膿毒癥病人預(yù)后的影響采用Logistic多因素回歸模型探討Tenascin-C對膿毒癥病人預(yù)后的獨立貢獻(xiàn)。結(jié)果表明,血清Tenascin-C水平、SOFA評分和休克與30 d病死率之間相關(guān)(表3)。ROC分析確定30 d病死率血清Tenascin-C閾值。曲線下面積(AUC)是0.717(95%CI=0.640-0.795;P<0.001)(圖2A)。血清Tenascin-C的水平診斷界值為56.9 ng/L(敏感性為75%,特異性
表3 Logistic多因素回歸預(yù)測膿毒癥174例30 d病死率
為61.4%)。進(jìn)一步應(yīng)用Kaplan-Meier曲線分析高血清Tenascin-C對膿毒癥病人預(yù)后的影響。與低血清Tenascin-C病人(<56.9 ng/L)相比,高血清Tenascin-C病人(≥56.9 ng/L)表現(xiàn)出30 d病死率增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log Rank卡方值=23.19,P<0.001)(圖2B)。
在這項研究中,我們測量了174例膿毒癥病人和80名健康對照血清的Tenascin-C水平,與健康對照組相比,膿毒癥病人血清Tenascin-C明顯升高。在膿毒癥病人中,血清Tenascin-C水平在死亡組高于存活組、休克組高于非休克組。進(jìn)一步分析顯示,血清Tenascin-C水平與膿毒癥臨床嚴(yán)重程度和炎癥介質(zhì)相關(guān),并且是獨立預(yù)后因素。血清Tenascin-C水平≥56.9 ng/L的膿毒癥病人,在30 d內(nèi)有更高的病死率。
Tenascin-C是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,在大多數(shù)成年健康組織不表達(dá),而在感染組織高水平表達(dá)[9]。我們觀察到膿毒癥病人血清Tenascin-C水平高于健康對照,說明Tenascin-C可能是膿毒癥的一種血清分子標(biāo)志。在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠,巨噬細(xì)胞表達(dá)的Tenascin-C增強(qiáng);而用CO處理抑制膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)的同時,也降低了LPS誘導(dǎo)的Tenascin-C表達(dá)。這表明Tenascin-C可能參與了膿毒癥的發(fā)病機(jī)制,成為一個潛在的治療靶點。
圖2 高血清Tenascin-C對膿毒癥病人預(yù)后的影響:A為ROC曲線用來確定區(qū)分存活組和死亡組的血清Tenascin-C的分界點;B為Kaplan-Meier生存曲線顯示相比于低血清Tenascin-C病人(<56.9 ng/L),高血清Tenascin-C病人(≥56.9 ng/L)30 d病死率升高
我們還發(fā)現(xiàn)血清Tenascin-C水平與膿毒癥的幾個指標(biāo),SOFA評分和血清肌酐呈正相關(guān)。SOFA評分用來估計膿毒癥癥狀嚴(yán)重程度和多器官衰竭[10],而血清肌酐反映了膿毒癥病人腎臟功能[11]。血清Tenascin-C還與膿毒癥病人的預(yù)后相關(guān):血清Tenascin-C水平是膿毒癥病人的一個獨立預(yù)后因素,Tenascin-C≥56.9 ng/L的病人30 d病死率升高。目前,ICU膿毒癥病人的一個主要挑戰(zhàn)是快速早期診斷和干預(yù)。因此,尋找新的生物標(biāo)志物是實現(xiàn)這一目標(biāo)并施行個體化治療和改善膿毒癥預(yù)后的關(guān)鍵[12]。我們的研究表明,作為具有多種生物學(xué)功能的蛋白,Tenascin-C可能通過眾多未知的機(jī)制參與膿毒癥的發(fā)病。
Tenascin-C是一個廣泛的炎癥誘導(dǎo)物。血清高水平Tenascin-C見于許多炎癥性疾病,如急性腦梗死[13]、膠原?。?4]、類風(fēng)濕心肌炎[15]和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[16]。在急性炎性關(guān)節(jié)炎和膝骨關(guān)節(jié)炎,升高的Tenascin-C能促進(jìn)炎癥因子表達(dá)和軟骨基質(zhì)降解,既是關(guān)節(jié)損傷的標(biāo)志物,又是關(guān)節(jié)破壞的促進(jìn)物[17]。我們的研究顯示膿毒癥病人血清Tenascin-C水平與血清炎癥因子,CRP、IL-6和TNF-α呈正相關(guān)。經(jīng)LPS誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞高表達(dá)Tenascin-C,后者增強(qiáng)巨噬細(xì)胞合成與分泌促炎細(xì)胞因子,從而促進(jìn)LPS誘導(dǎo)后Toll樣受體4(TLR4)的炎癥反應(yīng)[18]。Tenascin-C是TLR4炎癥軸的廣泛調(diào)控因子。如在心肌成纖維細(xì)胞,Tenascin-C通過激活TLR4上調(diào)IL-6的表達(dá)[19]。Tenascin-C與炎癥因子似乎存在著相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò),如TNF-α可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞表達(dá)Tenascin-C,并促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[20]。這種自反饋環(huán)路可以解釋Tenascin-C在急性炎癥中短暫高表達(dá),而在慢性炎癥和癌癥中持續(xù)高表達(dá)[21]。
本研究的局限性如下。首先,這是在一家醫(yī)院進(jìn)行研究的初步結(jié)果,需要通過多中心研究來進(jìn)一步證實。其次,Tenascin-C在急性炎癥中短暫高表達(dá)后恢復(fù)正常,而本研究只測量了膿毒癥病人入院初的血清Tenascin-C水平,入院后血清Tenascin-C的時間序列表達(dá)以及與預(yù)后的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。再次,血清Tenascin-C的來源還沒有確定,下一步實驗需要測量病人外周血單核細(xì)胞以及實驗動物組織巨噬細(xì)胞Tenascin-C的表達(dá)。
總之,本研究表明,膿毒癥病人血清Tenascin-C濃度升高。血清Tenascin-C的水平與臨床嚴(yán)重程度、全身炎癥反應(yīng)和30 d病死率相關(guān)。我們的研究結(jié)果提示Tenascin-C可能參與了膿毒癥的發(fā)病機(jī)制,并作為一個潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點。