孫芳園，許開亮，袁林，孫晶晶，韓耀國，雷鳴，張濤

膿毒癥是機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，具有較高的死亡風(fēng)險［1］。膿毒癥常常同時存在炎癥反應(yīng)和代償性抗炎反應(yīng)［2］。同時，促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)之間的復(fù)雜相互作用決定膿毒癥的結(jié)果［3］。因此，膿毒癥早期診斷和預(yù)后預(yù)測需要新的生物標(biāo)志物［4］。

肌腱蛋白（Tenascins）是一種細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，參與多種病理過程如炎癥、組織損傷、腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移［5］。Tenascin-C的持續(xù)高表達(dá)常見于炎癥、組織重塑和自身免疫性疾?。?］。感染和損傷能誘導(dǎo)Tenascin-C表達(dá)，促使機(jī)體對細(xì)菌脂多糖（LPS）產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。在小鼠膿毒癥模型中，LPS處理能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞表達(dá)Tenascin-C，并與LPS所誘導(dǎo)的促炎癥細(xì)胞因子有關(guān)［7］。這表明Tenascin-C可能是一種膿毒癥的炎癥促進(jìn)因子。然而，血清Tenascin-C在膿毒癥病人的表達(dá)和臨床意義尚不清楚。

在這項研究中，我們作了一個初步的臨床研究，探討膿毒癥病人血清Tenascin-C濃度和臨床嚴(yán)重程度、病死率與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。我們的研究將提供血清Tenascin-C水平為膿毒癥病人的預(yù)后標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 病例設(shè)計選取2016年1月至2017年6月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院普通內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）收治的膿毒癥病人174例，根據(jù)ACCP/SCCM共識會議［8］提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診。膿毒癥被定義為存在微生物學(xué)證實的感染、急性器官衰竭和全身炎癥反應(yīng)綜合征（至少兩個以下參數(shù)：①溫度＞38或＜36 ?C；②心率＞90次/分；③呼吸頻率＞20次/分或PaCO2＜32 mmHg；④血白細(xì)胞（WBC）計數(shù)＞12 000或＜4 000細(xì)胞/mm3，或＞10%不成熟的形式）。感染性休克是膿毒癥合并頑固性低血壓（收縮壓＜90 mmHg），需要補(bǔ)液和升壓藥維持血壓。應(yīng)用膿毒癥相關(guān)器官衰竭評估（Sepsis-related Organ Failure Assessment，SOFA）評分來定量估計病人器官損害嚴(yán)重程度。對這些病人實施了標(biāo)準(zhǔn)的膿毒癥治療，包括抗生素、機(jī)械通氣和液體復(fù)蘇。所有病人進(jìn)行監(jiān)測，直到他們從ICU出院或死亡，進(jìn)一步的隨訪至少30 d。同時選取80名性別和年齡相匹配的健康獻(xiàn)血者為健康對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并按照《赫爾辛基宣言》進(jìn)行。病人或家屬簽署知情同意書。

1.2 數(shù)據(jù)測量記錄所有病人的連續(xù)變量：年齡、SOFA評分、ICU天數(shù)、血清肌酐、乳酸、白細(xì)胞計數(shù)和血小板。所有實驗室數(shù)據(jù)為病人入院24 h內(nèi)抽血測得。記錄所有病人的分類變量：性別、感染部位、呼吸機(jī)應(yīng)用，感染性休克。終點為30 d存活。抽取入住ICU24 h內(nèi)的靜脈血液樣本，4°C離心5 000g×5 min，-80 °C 存儲。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清C反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。

1.3 ELISA檢測血清可溶性Tenascin-C按照商業(yè)化試劑盒（Fujioka，日本）的指示測量健康對照組和膿毒癥病人血清Tenascin-C水平［9］，用酶標(biāo)儀測量在450 nm吸光度。根據(jù)不同濃度重組人Tenascin-C建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定個病例的血清Tenascin-C濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。連續(xù)變量以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，用Mann-Whitney U秩和檢驗進(jìn)行兩獨立樣本的非參數(shù)檢驗。分類變量以頻率（百分比）表示，用χ2檢驗。Tenascin-C與連續(xù)變量之間的相關(guān)性用等級相關(guān)檢驗（Spearman’s rank correlation test）分析。用Logistic多因素回歸模型分析Tenascin-C對病人30 d病死率的獨立貢獻(xiàn)，以比值比（odds ratio）和95%置信區(qū)間（CI）表示。制作ROC曲線確定血清Tenascin-C對于存活者和死亡者之間的區(qū)分點。制作Kaplan-Meier曲線分析高血清Tenascin-C水平（≥56.9 ng/L）對膿毒癥病人30 d病死率的影響。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究人群在ICU連續(xù)性收治的174例膿毒癥病人中，男性112例，女性62例，中位年齡60歲。隨訪30 d后，死亡60例，病死率34.5%。與存活者相比，死亡組病人具有明顯增高的SOFA評分、血清肌酐、乳酸、CRP、IL-6和TNF-α水平（均P＜0.05）。同時，死亡組的感染性休克和呼吸機(jī)使用發(fā)生頻率較高（均P＜0.05）。ICU入院時膿毒癥病人的臨床特征見表1。

表1 膿毒癥病人174例臨床特征

2.2 血清Tenascin-C升高與膿毒癥病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析膿毒癥病人血清Tenascin-C水平（中位數(shù)為57.1 ng/L）明顯高于健康對照（中位數(shù)為24.1 ng/L）（P＜0.001）（圖1A）。在膿毒癥病人中，死亡組血清Tenascin-C水平（中位數(shù)為64.9 ng/L）明顯高于存活組（中位數(shù)為52.1 ng/L）（P＜0.001）（圖1B）。血清Tenascin-C在使用與不使用呼吸機(jī)病人之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1C）。休克病人血清Tenascin-C明顯高于無休克者（圖1D）。

2.3 血清Tenascin-C和臨床變量之間的相關(guān)性我們采用Spearman等級相關(guān)檢驗分析了血清Tenascin-C與連續(xù)變量的相關(guān)性。所有膿毒癥病人血清Tenascin-C與SOFA評分、血清肌酐、CRP、IL-6和TNF-α之間正相關(guān)（均P＜0.05）（表2）。

表2 膿毒癥病人血清Tenascin-C與其它定量指標(biāo)的相關(guān)性

圖1 膿毒癥病人和健康對照組的血清Tenascin-C的水平：A為膿毒癥病人（n＝174）血清Tenascin-C水平高于健康對照組（n＝80）（P＜0.001）；B為死亡組（n＝60）血清Tenascin-C水平高于存活組（n＝114）；C為使用呼吸機(jī)病人（n＝90）血清Tenascin-C水平和不使用呼吸機(jī)病人（n＝84）差異無統(tǒng)計學(xué)意義；D為休克者（n＝97）血清Tenascin-C水平高于無休克者（n＝77）

2.4 高血清Tenascin-C對膿毒癥病人預(yù)后的影響采用Logistic多因素回歸模型探討Tenascin-C對膿毒癥病人預(yù)后的獨立貢獻(xiàn)。結(jié)果表明，血清Tenascin-C水平、SOFA評分和休克與30 d病死率之間相關(guān)（表3）。ROC分析確定30 d病死率血清Tenascin-C閾值。曲線下面積（AUC）是0.717（95%CI＝0.640-0.795；P＜0.001）（圖2A）。血清Tenascin-C的水平診斷界值為56.9 ng/L（敏感性為75%，特異性

表3 Logistic多因素回歸預(yù)測膿毒癥174例30 d病死率

為61.4%）。進(jìn)一步應(yīng)用Kaplan-Meier曲線分析高血清Tenascin-C對膿毒癥病人預(yù)后的影響。與低血清Tenascin-C病人（＜56.9 ng/L）相比，高血清Tenascin-C病人（≥56.9 ng/L）表現(xiàn)出30 d病死率增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log Rank卡方值＝23.19，P＜0.001）（圖2B）。

3 討論

在這項研究中，我們測量了174例膿毒癥病人和80名健康對照血清的Tenascin-C水平，與健康對照組相比，膿毒癥病人血清Tenascin-C明顯升高。在膿毒癥病人中，血清Tenascin-C水平在死亡組高于存活組、休克組高于非休克組。進(jìn)一步分析顯示，血清Tenascin-C水平與膿毒癥臨床嚴(yán)重程度和炎癥介質(zhì)相關(guān)，并且是獨立預(yù)后因素。血清Tenascin-C水平≥56.9 ng/L的膿毒癥病人，在30 d內(nèi)有更高的病死率。

Tenascin-C是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在大多數(shù)成年健康組織不表達(dá)，而在感染組織高水平表達(dá)［9］。我們觀察到膿毒癥病人血清Tenascin-C水平高于健康對照，說明Tenascin-C可能是膿毒癥的一種血清分子標(biāo)志。在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠，巨噬細(xì)胞表達(dá)的Tenascin-C增強(qiáng)；而用CO處理抑制膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)的同時，也降低了LPS誘導(dǎo)的Tenascin-C表達(dá)。這表明Tenascin-C可能參與了膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，成為一個潛在的治療靶點。

圖2 高血清Tenascin-C對膿毒癥病人預(yù)后的影響：A為ROC曲線用來確定區(qū)分存活組和死亡組的血清Tenascin-C的分界點；B為Kaplan-Meier生存曲線顯示相比于低血清Tenascin-C病人（＜56.9 ng/L），高血清Tenascin-C病人（≥56.9 ng/L）30 d病死率升高

我們還發(fā)現(xiàn)血清Tenascin-C水平與膿毒癥的幾個指標(biāo)，SOFA評分和血清肌酐呈正相關(guān)。SOFA評分用來估計膿毒癥癥狀嚴(yán)重程度和多器官衰竭［10］，而血清肌酐反映了膿毒癥病人腎臟功能［11］。血清Tenascin-C還與膿毒癥病人的預(yù)后相關(guān)：血清Tenascin-C水平是膿毒癥病人的一個獨立預(yù)后因素，Tenascin-C≥56.9 ng/L的病人30 d病死率升高。目前，ICU膿毒癥病人的一個主要挑戰(zhàn)是快速早期診斷和干預(yù)。因此，尋找新的生物標(biāo)志物是實現(xiàn)這一目標(biāo)并施行個體化治療和改善膿毒癥預(yù)后的關(guān)鍵［12］。我們的研究表明，作為具有多種生物學(xué)功能的蛋白，Tenascin-C可能通過眾多未知的機(jī)制參與膿毒癥的發(fā)病。

Tenascin-C是一個廣泛的炎癥誘導(dǎo)物。血清高水平Tenascin-C見于許多炎癥性疾病，如急性腦梗死［13］、膠原?。?4］、類風(fēng)濕心肌炎［15］和系統(tǒng)性紅斑狼瘡［16］。在急性炎性關(guān)節(jié)炎和膝骨關(guān)節(jié)炎，升高的Tenascin-C能促進(jìn)炎癥因子表達(dá)和軟骨基質(zhì)降解，既是關(guān)節(jié)損傷的標(biāo)志物，又是關(guān)節(jié)破壞的促進(jìn)物［17］。我們的研究顯示膿毒癥病人血清Tenascin-C水平與血清炎癥因子，CRP、IL-6和TNF-α呈正相關(guān)。經(jīng)LPS誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞高表達(dá)Tenascin-C，后者增強(qiáng)巨噬細(xì)胞合成與分泌促炎細(xì)胞因子，從而促進(jìn)LPS誘導(dǎo)后Toll樣受體4（TLR4）的炎癥反應(yīng)［18］。Tenascin-C是TLR4炎癥軸的廣泛調(diào)控因子。如在心肌成纖維細(xì)胞，Tenascin-C通過激活TLR4上調(diào)IL-6的表達(dá)［19］。Tenascin-C與炎癥因子似乎存在著相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如TNF-α可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞表達(dá)Tenascin-C，并促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［20］。這種自反饋環(huán)路可以解釋Tenascin-C在急性炎癥中短暫高表達(dá)，而在慢性炎癥和癌癥中持續(xù)高表達(dá)［21］。

本研究的局限性如下。首先，這是在一家醫(yī)院進(jìn)行研究的初步結(jié)果，需要通過多中心研究來進(jìn)一步證實。其次，Tenascin-C在急性炎癥中短暫高表達(dá)后恢復(fù)正常，而本研究只測量了膿毒癥病人入院初的血清Tenascin-C水平，入院后血清Tenascin-C的時間序列表達(dá)以及與預(yù)后的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。再次，血清Tenascin-C的來源還沒有確定，下一步實驗需要測量病人外周血單核細(xì)胞以及實驗動物組織巨噬細(xì)胞Tenascin-C的表達(dá)。

總之，本研究表明，膿毒癥病人血清Tenascin-C濃度升高。血清Tenascin-C的水平與臨床嚴(yán)重程度、全身炎癥反應(yīng)和30 d病死率相關(guān)。我們的研究結(jié)果提示Tenascin-C可能參與了膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，并作為一個潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點。