李?lèi)?ài)君，張玉茹，夏雪梅，王彬容，王維香

(西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

乙醇(Ethanol)是一種有機(jī)化合物，俗稱(chēng)酒精。酒精可以給人體帶來(lái)快感，所以酒精類(lèi)飲品深受人們喜愛(ài)；但是過(guò)度飲酒會(huì)引起酒精中毒，酒精依賴(lài)，還可引發(fā)酒精相關(guān)的意外傷害、胰腺炎和胎兒酒精綜合征等疾病[1-2]。有證據(jù)表明，在大量飲酒者中，癌癥的發(fā)病率增高是由酒精的毒性所引起的。酒精可促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。酒精可以成為溶劑，幫助致癌物滲入細(xì)胞膜。酒精還可通過(guò)損害肝細(xì)胞而降低肝臟的解毒力，使肝臟無(wú)法消除或滅活致癌物。大量飲酒受試者(每天大于3次)相比于不飲酒的人更易罹患5種癌癥：上消化道/呼吸道癌癥、肺癌、女性乳腺癌、結(jié)直腸腫瘤及黑色素瘤，而輕中度飲酒受試者更易患除肺癌外的其余4種腫瘤[3]。乙醇也是常見(jiàn)的致畸源，妊娠期間攝入乙醇對(duì)胚胎發(fā)育有嚴(yán)重影響，胎兒酒精綜合征是最主要的發(fā)育畸形，表現(xiàn)為頭面部畸形、發(fā)育遲緩、心血管發(fā)育障礙和中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形等，這部分患兒給家庭和社會(huì)帶來(lái)了很大的負(fù)擔(dān)[4-5]。

斑馬魚(yú)(Daniorerio)是原產(chǎn)于印度河流的熱帶淡水魚(yú)，目前已成為世界排名第三的受科研工作者重視的模式生物，被廣泛應(yīng)用于發(fā)育、藥物篩選、毒理等方面研究。斑馬魚(yú)作為模式生物的優(yōu)勢(shì)很突出，具有胚胎體外授精發(fā)育，胚體透明，產(chǎn)卵量大，操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性，成本低，便于管理等優(yōu)點(diǎn)，并且和人類(lèi)基因有著87%的高度同源性，這意味著其實(shí)驗(yàn)結(jié)果大多數(shù)情況下適用于人體[6]。

為深入了解乙醇對(duì)胚胎發(fā)育的影響，本文研究了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的致死率、孵化率、致畸率以及心包大小、心跳強(qiáng)弱等的影響作用，對(duì)乙醇的毒害作用進(jìn)行初步評(píng)估，為乙醇對(duì)人體胚胎毒害的相關(guān)研究提供參考基礎(chǔ)，同時(shí)也為以斑馬魚(yú)為模型研究乙醇毒害提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體形正常，魚(yú)鱗和魚(yú)鰭無(wú)破損，游動(dòng)靈活，捕食敏捷的野生型斑馬魚(yú)雌雄成魚(yú)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

95%乙醇，分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

中科海斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)(青島中科海海水處理有限公司)，BCD-176DA型海爾冷藏冰箱(青島海爾股份有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(CB1350，上海皓莊儀器有限公司)，SZX10型OLYMPUS顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)Scope視屏成像系統(tǒng)，JA2003型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，BSA224S-CW型千分之一電子稱(chēng)量天平(賽多利科學(xué)儀器(北京)有限公司)，六孔板。

1.2 方法

胚胎培養(yǎng)液的配制：分別稱(chēng)量NaCl 3.5 g、KCl 0.05 g、NaHCO30.025 g、CaCl20.1 g，用少量純凈水溶解，再用純凈水定容至1 L。

1.2.1 處理液的配制

用95%乙醇配制10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1%、1.3%、1.5%、2%的乙醇，對(duì)照組采取胚胎培養(yǎng)液來(lái)培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.2.1 斑馬魚(yú)飼養(yǎng)

用中科海斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖，保證每日14 h的光照，養(yǎng)殖水為至少曝氣3 d，紫外線照射殺菌，并增氧的循環(huán)水，水溫控制在(28±1)℃。成年斑馬魚(yú)每日喂食2次適合熱帶魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)飼料小薄片及豐年蝦，喂養(yǎng)后及時(shí)清理缸中的糞便。

1.2.2.2 收集胚胎

實(shí)驗(yàn)前一天20:00按2:1的比例選取健康的性成熟活潑斑馬魚(yú)的雄魚(yú)和雌魚(yú)放入盛有養(yǎng)殖水的交配盒中，用隔板隔開(kāi)，進(jìn)行遮光處理。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天8:00將隔板拿開(kāi)，雌雄魚(yú)追逐開(kāi)始產(chǎn)卵，并記錄產(chǎn)卵時(shí)間。30 min后將魚(yú)卵挑出并清洗干凈，使其無(wú)異物附著，顯微鏡下檢查是否有不合格的胚胎，即觀察胚胎是否分裂均勻或死亡。

1.2.2.3 乙醇處理

將2 hpf胚胎在顯微鏡下觀察，選擇表面光滑、分裂均勻的胚胎放入6孔板中，每孔20只胚胎，處理液5 mL，觀察胚胎暴露至96 hpf的發(fā)育情況，重復(fù)3次。每隔24 h更換新鮮處理液，同時(shí)挑出死胎。

1.2.2.4 觀察記錄

分別在24、48、72、96 hpf觀察記錄胚胎死亡情況，在48、72、96 hpf記錄胚胎孵化情況以及在72 hpf記錄胚胎的畸形率；在各處理組中隨機(jī)挑取5個(gè)個(gè)體來(lái)進(jìn)行測(cè)量記錄各暴露階段斑馬魚(yú)測(cè)量指標(biāo)：48、72 hpf胚胎20 s的心跳次數(shù)，72、96 hpf胚胎的體長(zhǎng)，72 hpf胚胎的心包面積以及96 hpf胚胎眼睛背面長(zhǎng)度。

1.2.2.5 斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞死亡熒光染色

將72 hpf的孵化仔魚(yú)用5 mg/L吖啶橙溶液在28.5 ℃恒溫避光染色30 min，染色結(jié)束后用胚胎培養(yǎng)液漂洗3次，每次漂洗5 min，直到染色劑漂洗干凈，用0.05%麻醉劑麻醉1～3 min，用熒光顯微鏡觀察斑馬魚(yú)暴露后的細(xì)胞凋亡情況，并用ImageJ測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用改良寇式法[7]計(jì)算72 h時(shí)的EC50(受試動(dòng)物半數(shù)產(chǎn)生效應(yīng)變化的濃度)、96 h時(shí)的LC50(受試動(dòng)物半數(shù)死亡的濃度)以及IC50(受試動(dòng)物半數(shù)被抑制孵化的濃度)。用Excel單因素方差分析進(jìn)行處理組與對(duì)照組間的顯著性差異分析，*P<0.05，**P<0.01。用ImageJ軟件處理熒光圖片后可直接得出Area和Intden，平均密度=Intden/Area，以CK為相對(duì)值100，換算出不同濃度的處理圖片的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的孵化、致死和致畸毒性效應(yīng)

2.1.1 乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率的影響

由圖1和圖2(A)可知，對(duì)照組在48 hpf時(shí)斑馬魚(yú)胚胎開(kāi)始孵化，72 hpf內(nèi)全部孵化，而處理組在48 hpf并未開(kāi)始孵化，從96 hpf不同處理組的孵化率可以看出隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，孵化率下降，胚胎的顏色加深，并呈劑量效應(yīng)，表明乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化有抑制作用。96 hpf時(shí)對(duì)照、0.5%、1%、1.3%、1.5%和2%乙醇處理的胚胎孵化率分別為100%、100%、100%、100%、90%和15%；計(jì)算乙醇對(duì)胚胎96 h-IC50為1.56%(1.35%～1.80%，95%限制范圍)。

2.1.2 乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的致死效應(yīng)

與對(duì)照組相比，隨中毒時(shí)間延長(zhǎng)，乙醇處理組斑馬魚(yú)胚胎隨處理濃度增加死亡率上升，呈劑量效應(yīng)(圖2(B))。96 hpf時(shí)對(duì)照組、0.5%、1%、1.3%、1.5%和2%乙醇處理的胚胎死亡率分別為15%、15%、20%、25%、30%和65%；計(jì)算乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的96 h-LC50為1.22%(0.91%～1.63%，95%限制范圍)。

2.1.3 乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的致畸率影響

圖1(E)顯示乙醇處理后的斑馬魚(yú)胚胎出現(xiàn)心包水腫、尾部打結(jié)、卵黃淤血、脊柱彎曲及不孵化，在顯微鏡中還觀察到因水腫，斑馬魚(yú)胚胎無(wú)法保持平衡，且各種表型上的畸形情況隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而愈加顯著。從圖2(C)得知乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的致畸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而上升。72 hpf時(shí)對(duì)照組、0.5%、1%、1.3%、1.5%和2%乙醇處理的斑馬魚(yú)胚胎致畸率分別為5%、35%、70%、75%、80%和100%；計(jì)算乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的72 h-EC50為1.01%(0.77%～1.32%，95%限制范圍)。

圖1 乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎形態(tài)發(fā)育的影響(A：24hpf；B：48hpf；C：72hpf；D：96hpf；E：96hpf致畸部位)

2.2 乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎體長(zhǎng)發(fā)育、眼睛發(fā)育和心臟發(fā)育的影響

2.2.1 乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎體長(zhǎng)發(fā)育的影響

72和96 hpf測(cè)量斑馬魚(yú)孵化仔魚(yú)體長(zhǎng)時(shí)，2%處理組胚胎未孵化或尾部彎曲嚴(yán)重導(dǎo)致無(wú)法測(cè)量。圖3(A)表明，斑馬魚(yú)仔魚(yú)體長(zhǎng)隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而變短，且在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有很多胚胎因乙醇作用而未完全孵化或造成尾部彎曲打結(jié)，該致畸作用隨處理液濃度的增大而更加顯著。乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.3%時(shí)，乙醇對(duì)斑馬魚(yú)體長(zhǎng)抑制作用顯著。

2.2.2 乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎眼睛發(fā)育的影響

測(cè)量96 hpf斑馬魚(yú)眼睛直徑時(shí)，因2%處理組胚胎呈未孵化狀態(tài)，無(wú)法測(cè)量；從圖3(B)可以看出，與對(duì)照組相比，處理組斑馬魚(yú)眼睛直徑更短，并且該致畸作用呈劑量效應(yīng)。乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.3%時(shí)，乙醇對(duì)斑馬魚(yú)眼睛直徑抑制作用明顯。

圖2 乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率(A)、死亡率(B)及72hpf畸形率(C)的影響

2.2.3 乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心臟發(fā)育的影響

48 hpf時(shí)即觀察到體積分?jǐn)?shù)超過(guò)1.3%的乙醇斑馬魚(yú)處理組心跳緩慢且微弱無(wú)力。測(cè)量48和72 hpf斑馬魚(yú)胚胎心跳次數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3(C)。由圖3(C)可知，斑馬魚(yú)胚胎20 s心跳次數(shù)隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而減少，并呈劑量關(guān)系。48 hpf乙醇體積分?jǐn)?shù)1.3%時(shí)，斑馬魚(yú)心跳與對(duì)照組相比，心跳緩慢現(xiàn)象明顯；而72 hpf時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1%，斑馬魚(yú)心跳與對(duì)照相比已緩慢顯著。斑馬魚(yú)心跳次數(shù)與乙醇體積分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間均成劑量關(guān)系。測(cè)量72 hpf時(shí)斑馬魚(yú)胚胎心包面積(圖3(D))發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，經(jīng)乙醇處理的斑馬魚(yú)胚胎心包面積明顯增大，且呈劑量關(guān)系。在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.5%時(shí)，斑馬魚(yú)心包面積與對(duì)照組已有顯著差異。乙醇對(duì)胚胎心血管系統(tǒng)的致畸作用在許多脊椎動(dòng)物中都有發(fā)現(xiàn)[8]。錢(qián)林溪等[9]研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)胚胎循環(huán)系統(tǒng)對(duì)乙醇暴露非常敏感，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，不完整的循環(huán)系統(tǒng)等畸形率也逐漸升高，與本研究結(jié)果類(lèi)似。

注：*表示顯著；**表示極顯著

圖3 乙醇對(duì)斑馬魚(yú)胚胎體長(zhǎng)(A)、96 hpf眼睛直徑(B)、心跳(C)及72 hpf心包面積(D)發(fā)育的影響

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)越高對(duì)斑馬魚(yú)的毒害作用越強(qiáng)

72 hpf時(shí)對(duì)胚胎進(jìn)行熒光染色，從圖4可直接看出隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，所染色的胚胎熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，并且在卵黃處最強(qiáng)。用ImageJ軟件處理數(shù)據(jù)(見(jiàn)圖5)，也可直接看出相對(duì)熒光強(qiáng)度隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而呈劑量效應(yīng)。表明乙醇體積分?jǐn)?shù)越高對(duì)斑馬魚(yú)的毒害作用越強(qiáng)。

3 結(jié)論

本研究顯示，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加和處理時(shí)間延長(zhǎng)，斑馬魚(yú)胚胎的致畸率和致死率提高、孵化率降低、體長(zhǎng)變短、以及心跳減慢。乙醇導(dǎo)致的斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育致畸效應(yīng)主要表現(xiàn)為尾部打結(jié)、眼睛變小、心包水腫、脊柱彎曲，與胎兒酒精綜合征相似。細(xì)胞凋亡研究表明，乙醇處理導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞死亡。

圖4 72 hpf斑馬魚(yú)胚胎熒光染色圖

圖5 乙醇對(duì)72 hpf斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞死亡的影響