李 波，方志堅(jiān)，李 紅，楊 瞾

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾161005)

苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培最多的多年生豆科植物之一，具有高產(chǎn)、營養(yǎng)價(jià)值高、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)[1-2]。在國內(nèi)外廣泛種植，是我國土壤鹽堿化地區(qū)研究的重要牧草之一，在改良鹽堿化土壤和促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展方面具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。土壤鹽漬化是限制牧草產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一，因此，深入研究苜蓿的抗鹽堿能力，擴(kuò)大苜蓿種植范圍，提高生產(chǎn)力，對(duì)促進(jìn)土壤鹽堿化地區(qū)畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重大意義[4-5]。

60Co-γ輻射誘變育種是一種創(chuàng)造新品種和新種質(zhì)的重要手段[6]，目前誘變育種廣泛應(yīng)用于多種牧草，通過幼苗生理生化指標(biāo)的變化來探究輻射對(duì)牧草的影響，王月華等[7]發(fā)現(xiàn)50 Gy劑量60Co-γ輻射處理草地早熟禾(Poapratensis)能夠提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性；張玉等[8]發(fā)現(xiàn)100～150 Gy劑量能夠提高菊苣(Lactucasativa)幼苗中可溶性糖(Soluble sugar，SS)、可溶性蛋白(Soluble protein，SP)含量和SOD等酶活性，在輻射劑量高于150 Gy時(shí)表現(xiàn)為明顯抑制。Qi等[9]發(fā)現(xiàn)，50 Gy劑量的60Co-γ射線可以提高擬南芥(Arabidopsisthaliana)幼苗的耐鹽性并減輕其鹽害程度，同時(shí)，高睿等[10]發(fā)現(xiàn)100 Gy劑量60Co-γ射線能顯著提高烏拉爾干草(Glycyrrhizauralensis)種子苗期各生理指標(biāo)并提高其耐鹽性。處于逆境中的植物會(huì)大量積累H2O2和O2-，從而導(dǎo)致膜質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷，代謝速率變慢[11]。因此，植物會(huì)通過改變抗氧化酶系統(tǒng)來減輕活性氧對(duì)細(xì)胞膜及胞內(nèi)大分子的損傷，降低逆境對(duì)植物造成的傷害[12-13]。60Co-γ射線輻射是一種常見改良作物并提高其抗逆性的一種手段[14]，但利用60Co-γ射線輻照誘變苜蓿對(duì)其耐鹽性的研究卻鮮有報(bào)道，因此，本研究從60Co-γ輻射對(duì)苜蓿耐鹽性影響的角度出發(fā)，探討不同劑量的60Co-γ輻射對(duì)苜蓿幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、膜透性物質(zhì)及抗氧化酶活性的影響，以期了解幼苗對(duì)輻射的響應(yīng)，從而為苜?？鼓鏅C(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以黑龍江省畜牧研究所提供的經(jīng)過4種60Co-γ輻射劑量(600 Gy，900 Gy，1 200 Gy，1 500 Gy)的‘龍牧806’苜蓿種子為材料。輻射源由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院原子能利用研究所提供，輻射劑量依次為600，900，1 200和1 500 Gy，劑量率15 Gy·min-1，每份處理50 g種子，以同一批次相同數(shù)量未經(jīng)處理的種子作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1幼苗的培養(yǎng) 挑選籽粒飽滿的苜蓿種子，采用土培的方法種植在營養(yǎng)缽中(針葉土、營養(yǎng)土和珍珠巖按1∶2∶0.5比例進(jìn)行混合)，每3 d澆1次水，待苜蓿幼苗生長45 d后，將幼苗從土中取出。

1.2.2NaCl脅迫處理 用清水將各處理組及對(duì)照苜蓿幼苗根部清洗干凈，然后將其于1/2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)4～5 d。培養(yǎng)完畢后再將其放在質(zhì)量濃度為0.75%的NaCl溶液中處理72 h。每次處理各組長勢(shì)均勻的苜蓿幼苗15株，共3次重復(fù)，將植株根和葉片分開，置于密封袋中，保存于—80 ℃冰箱中備用，并對(duì)苜蓿的葉片及根進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.3生理生化指標(biāo)的測(cè)定方法 苜蓿幼苗各生理生化指標(biāo)的測(cè)定方法參照王學(xué)奎[15]和高俊鳳等[16]的方法，具體如下：可溶性蛋白(SP)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法、脯氨酸(Proline，Pro)含量測(cè)定采用酸性茚三酮法、可溶性糖(SS)含量測(cè)定采用蒽酮法、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法、相對(duì)電導(dǎo)率(Relative conductivity，RC)測(cè)定采用浸泡法、過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚比色法、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)活性測(cè)定采用比色法。

1.2.4數(shù)據(jù)處理及分析 用Excel 2010軟件進(jìn)行作圖，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及相關(guān)分析。

采用隸屬函數(shù)法對(duì)不同60Co-γ輻射劑量處理的苜蓿幼苗生理生化指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，隸屬函數(shù)值計(jì)算公式：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，反隸屬函數(shù)計(jì)算公式：R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中，Xi為指標(biāo)測(cè)定值，Xmin、Xmax為某項(xiàng)指標(biāo)的最小值和最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同60Co-γ輻射劑量對(duì)NaCl脅迫下苜蓿幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

如圖1A所示，苜蓿葉片和根可溶性蛋白(SP)含量隨輻射劑量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在600 Gy組含量最高，分別為70.45 mg·g-1和32.97 mg·g-1，比對(duì)照組增加18.22%和21.60%，輻射劑量為1 200 Gy和1 500 Gy時(shí)，葉片中SP含量比對(duì)照分別減少6.05%和24.04%；而根中SP含量比對(duì)照分別減少27.25%和40.04%，且苜蓿葉片SP含量均高于根。方差分析結(jié)果顯示，輻射組苜蓿葉片的SP含量與對(duì)照比較差異均不顯著(P>0.05)，而根的SP含量與對(duì)照比較差異均顯著(P<0.05)。600 Gy輻射劑量有利于苜蓿葉片和根SP含量的積累。

如圖1B所示，苜蓿葉片和根脯氨酸(Pro)含量隨輻射劑量的增加呈先升后降的趨勢(shì)，600 Gy和900 Gy輻射處理下，葉片中Pro含量為257.30 μg·g-1和233.69 μg·g-1，比對(duì)照增加17.33%和6.56%，而根中Pro含量為239.93 μg·g-1和213.87 μg·g-1，比對(duì)照增加23.47%和10.06%；當(dāng)輻射劑量為1 200 Gy和1 500 Gy時(shí)，葉片中Pro含量與對(duì)照組相比減少21.17%和33.17%，而根中Pro含量較對(duì)照組減少31.57%和52.38%，且葉片Pro含量均高于根，與對(duì)照組比較差異均顯著(P<0.05)。600 Gy和900 Gy輻射劑量有利于苜蓿葉片和根Pro的積累。

如圖1C所示，苜蓿葉片和根可溶性糖(SS)含量隨著輻射劑量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，600 Gy組SS含量最高，分別為19.71 mg·g-1和16.71 mg·g-1，比對(duì)照增加39.94%和24.53%，而900 Gy，1 200 Gy和1 500 Gy組葉片SS的含量分別比對(duì)照減少了17.75%，24.85%和31.66%；根SS的含量分別比對(duì)照減少了5.44%，29.35%和44.94%。除根900 Gy組與對(duì)照比較差異不顯著外(P>0.05)，其余各輻射組均與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。600 Gy輻射劑量有利于苜蓿葉片和根SS含量的積累。

圖1 NaCl脅迫下60Co-γ輻射龍牧806苜蓿葉片和根滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

2.2 不同60Co-γ輻射劑量對(duì)NaCl脅迫下苜蓿幼苗膜透性物質(zhì)的影響

如圖2A所示，苜蓿葉片和根丙二醛(MDA)含量隨輻射劑量的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，對(duì)照組MDA含量最低，分別為22.98 μmol·g-1和14.03 μmol·g-1，600～1 500 Gy組葉片MDA含量分別比對(duì)照增加19.23%，39.17%，60.72%，109.17%；而根MDA含量分別比對(duì)照增加23.69%，66.93%，91.07%，175.99%；高劑量(1 200 Gy和1 500 Gy)組的MDA含量與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。輻射處理導(dǎo)致苜蓿葉片和根部細(xì)胞膜的損傷，使各輻射組葉片和根的MDA含量均高于對(duì)照組。

如圖2B所示，苜蓿葉片和根相對(duì)電導(dǎo)率(RC)隨輻射劑量的增加呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，對(duì)照組RC最低，為55.54%和43.15%，1 500 Gy組RC最高，分別為89.09%和86.97%。在經(jīng)過不同劑量的60Co-γ輻照處理后，葉片RC分別比對(duì)照增加21.52%，35.43%，52.64 %和60.41 %，而根RC分別比對(duì)照增加39.01%，67.61%，80.45%和101.55%，且與對(duì)照比較差異均顯著(P<0.05)。

圖2 NaCl脅迫下60Co-γ輻射龍牧806苜蓿葉片和根膜透性物質(zhì)的變化

2.3 不同60Co-γ輻射劑量對(duì)NaCl脅迫下苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響

如圖3A所示，苜蓿葉片和根過氧化物酶(POD)活性均隨輻射劑量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，600 Gy組的葉片和根POD活性最高，為19 966.67 U·g-1FW·min-1和24 333.33 U·g-1FW·min-1，比對(duì)照組增加20.77%和32.97%，且與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，1 200 Gy和1 500 Gy組的葉片和根POD活性分別比對(duì)照減少35.69%和45.77%，而根POD活性分別比對(duì)照減少10.20%和39.16%。600 Gy和900 Gy劑量處理促進(jìn)苜蓿葉片和根POD活性的增加。

如圖3B所示，苜蓿葉片和根的多酚氧化酶(PPO)活性均隨輻射劑量的增加呈先升后降的趨勢(shì)，600 Gy組PPO活性最高，為1 686.67 U·g-1FW·min-1和2 523.33 U·g-1FW·min-1，與對(duì)照組的PPO活性相比增加108.23%和159.25%，葉片 900 Gy,1 200 Gy和1 500 Gy的酶活分別比對(duì)照增加43.62%,29.63%和11.52%，僅600 Gy輻射組葉片的PPO活性與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，根部900 Gy和1 200 Gy組PPO活性比對(duì)照高出144.52%和58.22%，且與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，僅1 500 Gy組的酶活比對(duì)照降低8.90%。600 Gy，900 Gy和1 200 Gy組根的PPO活性與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，600～1 200 Gy輻射劑量可促進(jìn)苜蓿的葉片和根PPO活性增加。

圖3 NaCl脅迫下60Co-γ輻射龍牧806苜蓿葉片和根兩種抗氧化酶的變化

2.3 苜蓿幼苗葉片和根系各生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析

表1對(duì)鹽脅迫下各測(cè)定指標(biāo)之間做相關(guān)性分析，可以看出各指標(biāo)間的相關(guān)程度各不相同。葉中Pro與SP和POD、POD與SP、PPO與MDA之間均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.969，0.965，0.997和0.967，MDA與RC呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.937。根中POD與SP，SS與Pro均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.997和0.965，SS與SP和POD呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.938和0.930，MDA與RC呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.927，其它各指標(biāo)間均存在一定程度的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。

表1 各指標(biāo)相關(guān)系數(shù)矩陣

注：*代表在0.05水平上顯著相關(guān)，**代表在0.01水平上顯著相關(guān)

Note:* represents significant correlation at the 0.05 level,and **represents significant correlation at the 0.01 level

2.4 苜蓿幼苗葉和根各生理生化指標(biāo)隸屬函數(shù)分析

應(yīng)用隸屬法對(duì)NaCl脅迫下不同輻射處理的苜蓿種子的幼苗葉片和根生理生化指標(biāo)進(jìn)行綜合分析得出(表2)，苜蓿幼苗葉片和根對(duì)NaCl抗性由強(qiáng)到弱依次為：600 Gy>0 Gy>900 Gy>1 200 Gy>1 500 Gy。隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)值越大，表明對(duì)苜蓿幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累越多、抗氧化酶活性越高及對(duì)膜損傷越小。依據(jù)輻射苜蓿種子的幼苗葉片和根生理生化的變化可知600 Gy輻射劑量可以提高苜蓿對(duì)NaCl的抗性。

表2 葉和根各指標(biāo)隸屬函數(shù)值

3 討論

植物苗期是對(duì)鹽脅迫做出反應(yīng)的敏感時(shí)期，植物各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的變化可以直接反映鹽害程度。鹽脅迫下，植物會(huì)出現(xiàn)鹽害癥狀，鹽害主要為離子毒害以及滲透脅迫[17-19]。為了維持植物自身正常的生理代謝，植物會(huì)通過滲透調(diào)節(jié)方式來降低鹽害的影響[20]。通過測(cè)定SS,SP,Pro等植物滲透調(diào)節(jié)的指標(biāo)來反映植物的抗鹽能力。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，不同劑量60Co-γ射線輻射，對(duì)NaCl脅迫下的苜蓿幼苗的SP，SS，Pro的影響作用不同。植物體內(nèi)SS，SP和Pro的含量與植物的抗逆性有關(guān)，逆境環(huán)境下，植物自身會(huì)主動(dòng)積累這些物質(zhì)以適應(yīng)外界環(huán)境的變化，對(duì)植物起著保護(hù)作用，達(dá)到自我修復(fù)的效果[21]。此外，SS和SP是生物體的重要組成部分，在植物的發(fā)育與代謝中具有重要作用[22]。鹽脅迫環(huán)境下，植物體內(nèi)SS和Pro會(huì)大量積累，以減少逆境環(huán)境對(duì)植物自身造成的傷害。隨著輻射劑量的增加，各生理指標(biāo)均呈先上升再下降的變化趨勢(shì)，其中SP和Pro含量在劑量600 Gy和900 Gy時(shí)高于對(duì)照組，說明低輻射劑量下苜蓿幼苗能進(jìn)行自我修復(fù)，提高其對(duì)輻射的損傷，但隨輻射劑量的增加，修復(fù)效果減弱，該結(jié)果與滕娟等[23]研究60Co-γ輻射對(duì)三七(Panaxnotoginseng)幼苗特性影響的結(jié)果一致。低劑量的輻射處理下，苜蓿幼苗中的脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量明顯高于對(duì)照組，這說明輻射處理可以在一定程度上提高苜蓿幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力，從而提高植物的耐鹽性。MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物，可以反映植物膜質(zhì)氧化度及植物遭受逆境傷害的程度，其含量越高膜脂過氧化程度越大[24]。植物細(xì)胞膜具有選擇透性，逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞膜受損導(dǎo)致電解質(zhì)外滲，因此當(dāng)植物受傷害愈嚴(yán)重，外滲出的物質(zhì)就會(huì)變多導(dǎo)致介質(zhì)導(dǎo)電性也變強(qiáng)，最終電導(dǎo)率就會(huì)升高，測(cè)得相對(duì)電導(dǎo)率的高低代表膜的透性強(qiáng)弱。本研究表明隨著輻射劑量的升高M(jìn)DA和RC均呈上升的趨勢(shì)，細(xì)胞膜損傷加重，破壞膜系統(tǒng)的完整性，李瑜等[25]研究60Co-γ輻射對(duì)桂花(Osmanthusfragrans)生理指標(biāo)影響也得到了相似結(jié)論，這說明，低劑量的輻射雖然可以一定程度上提高植物的耐鹽性，但輻射還是會(huì)引起苜蓿幼苗細(xì)胞膜脂的過氧化作用，以及在一定程度上破壞脂膜透性，并且隨著劑量的增加，膜脂過氧化作用加劇。

在NaCl脅迫下，為適應(yīng)鹽脅迫條件對(duì)苜蓿的影響，苜蓿體內(nèi)抗氧化酶POD、PPO等可緩解因逆境對(duì)植物造成的傷害，這些抗氧化酶的活性可以反映植物自身清除活性氧的能力，也代表植物抗逆性的強(qiáng)弱[26]。POD是植物生命代謝中重要的抗氧化酶，參與清除由逆境植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，減少植物細(xì)胞受到損害，本試驗(yàn)中，輻射劑量為600 Gy時(shí)，POD活性達(dá)到最大，說明在此劑量下POD清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的能力最強(qiáng)，從而緩解了鹽脅迫對(duì)苜蓿的活性氧氧化損傷作用，輻射劑量繼續(xù)增加，活性氧清除能力減弱，氧代謝平衡失調(diào)，導(dǎo)致酶活性下降[27]。PPO也是植物中常見的一種酶，在植物完好時(shí)PPO無活性，但是當(dāng)植物受到損傷時(shí)便表現(xiàn)出活性，本試驗(yàn)在鹽脅迫條件下苜蓿受到了鹽害，導(dǎo)致PPO活性增強(qiáng)，由于根部與鹽環(huán)境直接接觸，從而導(dǎo)致苜蓿根部的POD，PPO的活性要大于葉片的POD和PPO活性，這說明苜蓿根部對(duì)輻射的敏感性在一定程度上要大于其葉片的敏感性[28]。通過對(duì)苜蓿幼苗各指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)的綜合分析，可以發(fā)現(xiàn)低輻射劑量(600 Gy)有利于提高苜蓿的耐鹽性。

4 結(jié)論

60Co-γ射線對(duì)鹽脅迫下的‘龍牧806’苜蓿幼苗生理生化指標(biāo)的影響較明顯，即低輻射劑量(600 Gy)能夠促進(jìn)SS等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，減少膜損傷，同時(shí)，抗氧化酶活性升高，活性氧清除能力增強(qiáng)，保持活性氧代謝平衡。隨著輻射劑量的增加，膜系統(tǒng)完整性遭到破壞，電解質(zhì)外滲導(dǎo)致MDA含量和RC上升。相關(guān)性分析結(jié)果表明，葉中Pro與SP和POD、POD與SP、PPO與MDA之間均呈極顯著正相關(guān)，根中POD與SP，SS與Pro均呈極顯著正相關(guān)。隸屬函數(shù)綜合分析可知，600 Gy是‘龍牧806’苜蓿誘變育種較合適劑量。