李季膚，韓佳芮，賈怡丹，張郎織，王文強，王志勇*，陳志堅,*

(1. 熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室/海南大學(xué)林學(xué)院，海南 ?？?570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，海南 海口 571101)

鋁(Aluminum，Al)是地殼中分布最廣、含量最豐富的金屬元素，其通常以難溶性硅酸鹽或氧化鋁的形式存在[1]。當(dāng)土壤pH低于5.0時，鋁以Al3+離子形式存在，Al3+離子會對植物細胞產(chǎn)生毒害[2]。鋁對植物的毒害表現(xiàn)在抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、破壞細胞骨架和影響鈣離子通道等方面，進而阻礙了細胞分裂和抑制根系的伸長，進一步影響根系對水分和養(yǎng)分的吸收[3]。因此，鋁毒害是酸性土壤中限制作物生長和產(chǎn)量的重要因素之一[4]。為適應(yīng)酸鋁脅迫，植物形成了外部解鋁毒和內(nèi)部忍耐兩方面耐鋁機制。通過根系分泌有機酸(如蘋果酸，檸檬酸和草酸等)，與根際鋁離子螯合，從而阻止Al3+進入細胞被認為是植物外部解鋁毒機制[5]。內(nèi)部忍耐機制包括把細胞中的鋁離子隔離在液泡、質(zhì)外體和細胞壁中緩解鋁毒害；增強細胞的抗氧化脅迫能力在植物耐鋁毒害中也發(fā)揮著重要作用[6]。

地毯草(Axonopuscompressus)是禾本科地毯草屬多年生草本植物，可用于公共綠地，控制水土流失和路邊草坪等方面，又因其稈葉柔嫩，可作為優(yōu)質(zhì)牧草[7]。地毯草起源于美國南部及熱帶美洲，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，也是我國熱帶地區(qū)重要的熱帶暖季型草坪草之一[8]。通過對鋁脅迫下地毯草、鈍葉草(Stenotaohrumsecundatum)、結(jié)縷草(Zoysiajaponica)、假檢草(Eremochloaophiuroides)和狗牙根(Cynodondactylon)等常見暖季型草坪草生長和元素分析發(fā)現(xiàn)，地毯草具有較高的生物量和養(yǎng)分吸收能力，暗示了地毯草具有較強的耐鋁毒能力[9]。然而，迄今為止，國內(nèi)外主要對地毯草耐鋁能力進行評價分析[10-11]，對地毯草響應(yīng)鋁及耐鋁毒機制仍不清楚，并且，地毯草鋁響應(yīng)基因仍未見有相關(guān)報道。

ABC(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運蛋白是1個大家族蛋白，其能夠借助水解ATP釋放的能量完成底物的跨膜運輸[12]。因其豐富的底物選擇性，ABC轉(zhuǎn)運蛋白在生物體內(nèi)參與多種重要生理過程。ABCG轉(zhuǎn)運蛋白屬于ABC家族中的1個亞家族成員，ABCG轉(zhuǎn)運蛋白包含核苷酸結(jié)合域(Nucleotide-binding domain，NBD)和跨膜結(jié)構(gòu)域(Transme-brane domain，TMD)[13]。其中，親水性NBD結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合水解ATP，為跨膜運輸提供能量[14]，而疏水性TMD結(jié)構(gòu)域由4-6個跨膜α螺旋構(gòu)成，形成跨膜通道，并能夠特異識別底物[15]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和煙草(Nicotianatabacum)等植物中，相繼報道了ABCG轉(zhuǎn)運蛋白的功能。例如，在擬南芥中，AtABCG40參與ABA的吸收以及重金屬鉛(Pb)的轉(zhuǎn)運，對植物響應(yīng)金屬脅迫具有重要作用[16]。此外，AtABCG14參與擬南芥根部細胞分裂素向地上部的運輸[17]，而AtABCG36參與了生長素的運輸[18]。因此，ABCG轉(zhuǎn)運蛋白在植物器官發(fā)育、激素運輸和抵抗重金屬脅迫等方面起重要作用。本研究以地毯草為實驗材料，克隆獲得了地毯草ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因AcABCG1，并對AcABCG1基因進行了生物信息學(xué)和基因表達模式分析，為研究地毯草適應(yīng)鋁毒脅迫機制提供候選基因資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用實驗材料為地毯草野生種質(zhì)“A58”[10]，采集于廣東廣州，現(xiàn)保存于海南大學(xué)林學(xué)院。

1.2 實驗方法

1.2.1材料培養(yǎng)與處理 參考張靜等[11]方法進行地毯草預(yù)培養(yǎng)。挑選生長一致的地毯草匍匐莖，在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)7 d。隨后，選取根長5 cm左右的幼苗，在光照培養(yǎng)箱中進行鋁處理。實驗設(shè)置4個不同鋁濃度處理，分別為0(CK)，50，100，200 μM AlCl3(pH 4.2)，鋁處理時間為24 h。另外，在100 μM AlCl3(pH 4.2)濃度下，設(shè)置不同鋁時間處理，分別為0，12，24 h。每個處理設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)。分別在鋁處理前、后，用根系掃描儀(EPSON，日本)掃描植株根長圖片。

1.2.2相對根長測定 參考羅佳佳等[19]方法進行相對根長測定。使用Image J(National Institutes of Health，美國)軟件統(tǒng)計根長。將鋁處理前的根長記錄為RLAl0h或RLCK0h，鋁處理后記錄為RLAlnh或RLCK0h。根據(jù)公式(RLAlnh-RLAl0h)/(RLCKnh-RLCK0h)×100%計算相對根長。

1.2.3總RNA提取和cDNA合成 參考TRNzol Universal總RNA提取試劑(TIANGEN，中國)說明書提取地毯草總RNA。取0.1 g植物樣品，加入0.7 mL TRNzol提取液，充分研磨后，室溫放置5 min后，4℃，10 000 rpm離心3 min。吸取上清液，并加入5 M NaCl和氯仿，充分混勻，4℃，13 000 rpm離心10 min。吸取上清，加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min后，4℃，13 000 rpm離心10 min。棄上清，加入1 mL 75%乙醇，4℃，5 000 rpm離心3 min。棄上清，風(fēng)干沉淀，加入無RNase水，充分溶解RNA。參考RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒(Thermo Fisher，美國)方法合成cDNA第一鏈。在PCR管中加入2 μg RNA、1 μL Oligo (dT)18，并加入Water nuclease-free至12 μL。于65℃反應(yīng)5 min后，加入4 μL 5×Reaction Buffer，2 μL dNTP Mix，1 μL RiboLock RNase Inhibitor和 1 μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase。于42℃反應(yīng)60 min，70℃反應(yīng)5 min。反應(yīng)結(jié)束后，樣品于—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4AcABCG1基因克隆 根據(jù)地毯草根系鋁響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，篩選獲得AcABCG1基因全長序列；利用Oligo7設(shè)計上游引物AcABCG1-F和下游引物AcABCG1-R(表1)；以根系cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的條帶，與pMD18-T載體(TaKaRa，日本)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)菌液PCR篩選陽性克隆并進行測序分析，獲得AcABCG1全長cDNA序列，并將序列提交至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，基因序列號為MN310539。

1.2.5生物信息學(xué)分析 采用EXPASY在線網(wǎng)站分析蛋白的二級(https://web.expasy.org/protparam)，釆用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)在線網(wǎng)站進行跨膜結(jié)構(gòu)域分析；采用WoLF PSORT(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)在線軟件進行基因的亞細胞定位預(yù)測；采用NCBI網(wǎng)站進行保守結(jié)構(gòu)域分析；采用MEME在線軟件(http://meme-suite.org)進行蛋白Motif分析；運用DNAMAN進行多序列比對分析；采用MEGA 7軟件進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.2.6熒光定量PCR分析 使用QuantStudioTMReal-Time PCR(Thermo Fisher，美國)系統(tǒng)和SYBR Green(Vazyme，中國)定量試劑盒進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL)為：10 μL 2×SYBR Green PCR master mix，6 μL dd H2O，1 μL引物(10 μM)，2 μL稀釋60倍的cDNA模板。反應(yīng)程序為：95℃ 1 min，95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，40次循環(huán)。AcABCG1基因相對表達量=目的基因(AcABCG1)表達量/內(nèi)參基因(AcEF-1a)表達量。內(nèi)參基因AcEF-1a的NCBI序列號為MN310540。AcABCG1和AcEF-1a定量PCR引物如表1所示。

表1 AcABCG1基因克隆和定量PCR引物

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel 2003進行平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)誤計算和圖表繪制，采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件(IBM SPSS Statistics 20)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鋁濃度處理對地毯草根系生長的影響

本研究首先分析了不同鋁濃度處理對地毯草根系生長的影響。從(圖1A)可以看出，鋁處理顯著抑制地毯草根伸長，但不同鋁濃度處理抑制的程度不一樣，鋁濃度越高，相對根長受抑制程度越大。在50，100，200 μM鋁處理24 h下，地毯草相對根伸長分別為60.8%，47.4%和32.4%(圖1B)。結(jié)果表明鋁毒顯著抑制地毯草根系生長。

2.2 AcABCG1的克隆和保守結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果獲得的AcABCG1基因序列，設(shè)計正向和反向引物，以鋁處理下地毯草根系cDNA為模板，擴增出AcABCG1基因cDNA全長序列，基因大小為2 434 bp(圖2)，并且，經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)AcABCG1基因全長序列與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。利用ExPASyProt軟件分析發(fā)現(xiàn)AcABCG1基因編碼811個氨基酸殘基，蛋白分子量為91.85 kD，理論等電點為8.83，為親水性蛋白。CDD Tools預(yù)測表明，AcABCG1屬于ABCG亞家族成員，AcABCG1蛋白含有ABC轉(zhuǎn)運蛋白的保守序列，即核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域特征序列(圖3)。

圖1 鋁處理對地毯草根生長的影響

圖2 AcABCG1全長cDNA的克隆

2.3 AcABCG1蛋白理化性質(zhì)分析

利用TMHMM Server V2.0 軟件對AcABCG1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果表明該蛋白包含6個跨膜結(jié)構(gòu)域(圖4)。SignalP 5.0 server軟件分析顯示，該基因不存在信號肽構(gòu)，表明該蛋白不是分泌蛋白。利用WoLF PSORT預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，AcABCG1蛋白定位于細胞膜上，暗示該蛋白為膜蛋白。

2.4 系統(tǒng)進化樹分析

從系統(tǒng)進化樹可以看出，ABCGs蛋白可以被分為I、II、III和IV共4類群(圖5)。其中，地毯草AcABCG1蛋白屬于第II類群，與擬南芥AtABCG7，AtABCG41，AtABCG18，AtABCG29和AtABCG38，以及水稻OsABCG15，OsABCG26和OsABCG43等同屬1個分支，同源性最高。

圖3 AcABCG1保守結(jié)構(gòu)域分析

圖4 AcABCG1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析

2.5 不同處理對AcABCG1基因表達的影響

本研究進一步分析了pH、100 μM鋁(Al)、40 μM鎘(Cd)和20 μM鑭(La)處理對AcABCG1基因表達的影響。從圖6A可以看出，相對pH5.8對照處理，Al,Cd和La處理均顯著增強了AcABCG1基因在地毯草根系中的表達，且AcABCG1基因在Al處理條件下的表達量最高，Cd處理次之。然而，低pH(pH4.2)對AcABCG1基因表達影響不明顯。

從圖6B可以看出，隨著Al處理濃度增加，AcABCG1基因表達量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。并且，AcABCG1的表達量在100 μM鋁處理下達到最大，是對照(0 μM Al)處理下的3.5倍(圖6B)。類似的，隨Al處理時間的延長，AcABCG1基因表達量逐漸增加，且在鋁處理48 h條件下表達量最高(圖6C)。

2.6 AcABCG1基因組織表達分析

本研究進一步分析了AcABCG1基因在地毯草不同組織中的表達模式。從圖7A可以看出，地毯草AcABCG1基因在根中的表達量最高，莖次之，葉部最低。此外，AcABCG1基因主要在0～1 cm根尖中表達，其次為1～2 cm根部，而AcABCG1在大于3 cm的根中表達量最低，僅為0～1 cm根尖的1.2%(圖7B)。

3 討論與結(jié)論

鋁毒害破壞植物根尖的結(jié)構(gòu)，抑制根系生長[21-22]。鋁毒抑制根系生長因不同植物或基因型有所差異，并且，熱帶和亞熱帶地區(qū)的植物經(jīng)過長期的進化，對酸性土壤鋁毒形成了較強的適應(yīng)性[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在鋁處理下，相對鈍葉草、結(jié)縷草、假檢草、狗牙根、海濱雀稗(Seashorepaspalum)和馬尼拉草(Zoysiamatrella)等草坪草，地毯草具有最高的根生物量，暗示了地毯草具有較強的耐鋁能力[16]。然而，不同地毯草的耐鋁能力具有基因型差異，其中，地毯草A58為耐鋁基因型[17]。因此，本研究以鋁處理下的地毯草“A58”為材料，克隆了地毯草根系鋁響應(yīng)AcABCG1基因(圖2)。

ABC轉(zhuǎn)運蛋白是1個龐大的蛋白家族，在擬南芥、水稻和煙草等植物中已克隆并鑒定出多個ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族成員[8]。ABCG屬于ABC蛋白家族成員。在擬南芥中，具有43個ABCG；在水稻中，具有40個ABCG；而在煙草中，具有134個ABCG[24-26]。ABCG轉(zhuǎn)運蛋白包含NBD結(jié)合域和TMD結(jié)構(gòu)域；依據(jù)NBD和TMD的組成，可將ABCG轉(zhuǎn)運蛋白家族分為兩類。一類是WBC型，其結(jié)構(gòu)為NBD-TMD，稱為半分子轉(zhuǎn)運蛋白。另一類為PDR型，結(jié)構(gòu)為NBD-TMD-NBD-TMD，稱為全分子轉(zhuǎn)運蛋白[27]。在本研究中，經(jīng)預(yù)測地毯草AcABCG1蛋白具有ABCG轉(zhuǎn)運蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)為NBD-TMD，為半分子轉(zhuǎn)運蛋白(圖3，4)。結(jié)果表明地毯草AcABCG1蛋白特性和結(jié)構(gòu)特征均具備與其他植物ABCGs的相似特點。

圖7 地毯草AcABCG1基因組織表達分析

系統(tǒng)進化樹分析表明，地毯草AcABCG1蛋白屬于第II類群，與擬南芥AtABCG7，AtABCG41，AtABCG18，AtABCG29和AtABCG38，以及水稻OsABCG26，OsABCG15和OsABCG43同源性最高(圖5)。與地毯草AcABCG1同源的ABCG蛋白在調(diào)控植物激素和金屬離子轉(zhuǎn)運中具有重要作用。例如，金屬Cd處理增強了OsABCG43在水稻根中的表達，并且，超表達OsABCG43基因能夠增強酵母細胞的耐Cd能力，暗示了OsABCG43基因可能參與了水稻鎘離子的轉(zhuǎn)運，把Cd積累在根部的細胞器(如液泡)中，從而緩解金屬Cd毒害[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，地毯草AcABCG1蛋白具有典型的ABCG蛋白結(jié)構(gòu)特點，并與上述蛋白具有較高的同源性，暗示了地毯草AcABCG1可能具有轉(zhuǎn)運金屬鋁離子的功能。

對地毯草AcABCG1基因表達分析發(fā)現(xiàn)金屬處理均顯著增強了AcABCG1基因在根系中的表達，其中，AcABCG1基因在Al處理下的表達量最高，表明了AcABCG1基因在轉(zhuǎn)錄水平上能響應(yīng)鋁毒脅迫(圖6)。類似的，研究發(fā)現(xiàn)OsABCG43主要在水稻根系中表達，并且，金屬Cd處理增強了OsABCG43在水稻根中的表達，暗示其可能與根系Cd離子的轉(zhuǎn)運相關(guān)[28]；此外，金屬Pb處理增強了擬南芥AtABCG40/AtPDR12在根和莖中的表達，并且，超表達該基因能增強植株的耐Pb能力[29]。因此，以上結(jié)果暗示了地毯草AcABCG1基因可能具有轉(zhuǎn)運鋁離子的功能，但其生物學(xué)功能仍需做進一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究克隆了地毯草根系鋁響應(yīng)AcABCG1基因；AcABCG1基因在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)鋁脅迫；研究結(jié)果暗示了AcABCG1基因可能具有轉(zhuǎn)運鋁離子的生物學(xué)功能。