林昕,梁田田,盧瑛,2,3*

南美對蝦主要過敏原檢測樣品的快速簡便預(yù)處理方法

林昕1,梁田田1,盧瑛1,2,3*

1. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院, 上海 201306 2. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心, 上海 201306 3. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(上海), 上海 201306

為了開發(fā)一種適合于試紙條法快速檢測南美白對蝦主要過敏原原肌球蛋白（Tropomyosin，Tm）的簡單快速的樣品前處理方法。本實驗設(shè)計了8種預(yù)處理方法，并通過BCA蛋白定量、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫印跡和層析試紙條檢測比較分析了8種方法的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用方法8制備的樣品提取液蛋白質(zhì)濃度適中（2.5 mg/mL），雜蛋白較少且對磁性納米探針標(biāo)記的免疫層析檢測干擾少，較適合于現(xiàn)場快速檢測。本研究優(yōu)化的蝦類過敏原Tm的樣品前處理方法為：用丙酮抽提蝦肉至無色，加入20 mM Tris-HCl（pH 9.2）勻漿30 s，超聲處理10 min，加熱5 min，冷卻后用迷你離心機離心10 min，所得上清液即為樣品。

原肌球蛋白; 南美白對蝦; 預(yù)處理

食物過敏(Food allergy，F(xiàn)D)作為一類常見的過敏性疾病，近年來發(fā)病率逐漸升高，幾乎5%的成人和8%的兒童有食物過敏的癥狀，已嚴(yán)重影響了人們的生活健康[1-3]。南美白對蝦()是我國人群最常食用的，也是極易引起過敏的特有的甲殼類動物之一[4]，其肉味鮮美,營養(yǎng)豐富,是我國蝦類養(yǎng)殖的重要對象,遠(yuǎn)銷日本及東南亞國家。原肌球蛋白是南美白對蝦中引起過敏的主要過敏原[5]，廣泛存在于各種鮑、海螺、蛤蜊、竹蟶、貽貝、牡蠣和章魚等軟體動物中以及蟹、龍蝦和蝦等甲殼類水產(chǎn)品，并且具有較高的同源性[6]。原肌球蛋白是一種過敏性糖蛋白，含糖量為4%左右，分子質(zhì)量在38~40 kDa之間，等電點為4.5[7]。

目前市場上原肌球蛋白的檢測方法主要有質(zhì)譜、ELISA、PCR等檢測手段。質(zhì)譜方法檢測靈敏度高，檢測性能穩(wěn)定，但存在著實驗操作費時、所用儀器昂貴、檢測費用相對較高等缺點[8]不宜進行現(xiàn)場快速檢測；ELISA方法檢測靈敏度高，檢測限可以達到ng級、特異性高、穩(wěn)定性好，但存在操作耗時、需要特定環(huán)境等缺點，不合適進行現(xiàn)場快速檢測[9]。PCR方法穩(wěn)定性好，既能定性也可以定量，但檢測過程易因操作不當(dāng)受到污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，存在操作要求技術(shù)性強、費時等缺陷[6,10]，也不適合進行現(xiàn)場快速檢測。由于質(zhì)譜技術(shù)、ELISA和PCR方法在便捷程度、檢測速度等方面的局限使其難以滿足市場應(yīng)用的需求，因此，除了加強食品的加工、銷售過程管理外，建立快速、高效、精確的原肌球蛋白檢測方法也顯得尤為重要。磁性納米探針標(biāo)記免疫層析檢測技術(shù)是近十幾年來迅速發(fā)展的一種新型的免疫標(biāo)記分析技術(shù)，其優(yōu)點是簡單快速、無需檢測儀器[10]，且成本低、無污染[11]、無需專門培訓(xùn)，適合于現(xiàn)場快速檢測[12]，具有廣闊的市場前景及應(yīng)用價值[13]。磁性納米免疫層析試紙條可以對南美白對蝦中的主要過敏原進行快速檢測，但其前處理方法復(fù)雜且耗時長，不利于進行現(xiàn)場檢測。

目前常用的蛋白質(zhì)分離純化方法主要有透析和超濾法，沉淀法（硫酸銨沉淀、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等），層析法（離子交換層析、凝膠層析、親和層析等）[14-18]。Lasekan AO[19]用40%~60%的硫酸銨來純化蝦中的主要過敏原原肌球蛋白。Gámez C和Rahman AMA[20]等將蝦制成了丙酮粉然后利用等電點的方法純化了蝦中的主要過敏原。傅玲琳等[21]利用硫酸銨沉淀分離純化方法純化了凡納對蝦主要過敏原—原肌球蛋白，雖然這些方法可以得到純度較高的Tm，但耗時長，濃度較低，并且不易回收利用，儀器復(fù)雜，對操作人員的技術(shù)要求高，不適合于現(xiàn)場快速檢測。

本研究簡化了前處理步驟，縮短了時間，運用簡易設(shè)備快速提取原肌球蛋白，以期與免疫層析檢測技術(shù)相配套，為過敏原原肌球蛋白的快速現(xiàn)場檢測提高技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

新鮮的南美白對蝦購自上海市浦東新區(qū)農(nóng)工商超市。甘氨酸購買于ABCONE公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購買自上海威奧生物公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tween-20、Tris、四甲基乙二胺(TEMED)等均購自美國Sigma公司。MES(2－嗎啉乙磺酸，Alafa公司)；EDC［1－乙基－(3－二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽］，NHS(N－羥基琥珀酰亞胺)購自美國PIERCE公司。磷酸氫二鈉、丙酮、氯化鈉、碳酸鈉、BCA蛋白定量檢測試劑盒、磷酸二氫鈉、購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。180 nm羧基磁珠、2 mL磁力架購買自上海奧潤微納新材料科技有限公司；硝酸纖維素膜（CN140）、樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊、購買于上海捷寧生物科技有限公司。垂直板型電泳槽、半干式轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司)；組織勻漿器購自上海蘇寧易購；垂直混合器(HS-3)購買于寧波新芝生物科技股份有限公司；迷你離心機購（D1008E）購于江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；高速冷凍離心機（Centrifuge 5810 R）購于德國Eppendorf公司；恒溫磁力攪拌器（08-2G）購于上海馳久儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蝦的過敏原樣品提取和制備樣品前處理方法前處理方法1是將蝦去殼去頭去蝦線處理，然后按質(zhì)量和體積比1:5的比例加入10 Mm/L PBS，用電動勻漿器勻漿30 s，將所得混合液進行磁力攪拌10 min，加熱5 min后冷卻，再用迷你離心機離心（3000 rpm）10 min后取上清作為樣品備用。前處理方法2是在方法1的基礎(chǔ)上，增加了在勻漿前先用丙酮將蝦肉處理至無色措施；前處理方法3是將方法1中將混合液進行磁力攪拌變成了超聲處理，其它處理過程同方法1。前處理方法4在方法1的基礎(chǔ)上，增加了在勻漿前先用丙酮將蝦肉處理至無色措施，并用高速離心機進行離心（12000 rpm）。前處理方法5在方法1的基礎(chǔ)上將混合液進行超聲處理，離心時用的是高速離心機（12000 rpm）。前處理方法6相較于方法1增加了在在勻漿前先用丙酮將蝦肉處理至無色措施，勻漿時加的是含0.5 M NaCl的20 mM Tris-HCl。方法7相比較于方法1勻漿用的緩沖液是含0.5 M NaCl的20 mM Tris-HCl。前處理方法8是在方法1的基礎(chǔ)上先用丙酮將蝦肉處理至無色用的勻漿緩沖液是含0.5 M NaCl的20 mM Tris-HCl，所得的勻漿液進行的是超聲處理。其區(qū)別如表1所示：

表1 8種前處理方法

1.2.2 BCA蛋白質(zhì)含量分析利用BCA蛋白定量試劑盒對樣品的蛋白質(zhì)含量進行定量檢測。

1.2.3 SDS-PAGE分析蛋白組分對不同方式提取的蛋白粗提液組分進行SDS-PAGE電泳分析，濃縮膠和分離膠分別是5%和12%，上樣緩沖液和待分析樣品以1:1的比例混合，沸水煮沸5 min，每孔上樣量為每孔8 μL，先是80 V電壓跑20 min之后120 V電壓跑50 min，當(dāng)溴酚藍(lán)指示到達底部后電泳結(jié)束。之后用染料考馬斯亮藍(lán)Ｒ-250進行染色2 h，最后經(jīng)脫色液進行充分洗脫拍照。

1.2.4 Western-blotting分析過敏原組分對不同方式提取的蛋白粗提液組分進行SDS-PAGE電泳后，干轉(zhuǎn)膜儀90 mA電流下60 min轉(zhuǎn)到PVDF膜上，再對膜用5%脫脂奶粉封閉60 min。用PBST洗滌3次后加入實驗室自制的Tm過敏原特異性抗體5G5E[22]（1:1000），該單抗對甲殼類水產(chǎn)品中的主要過敏原肌球蛋白具有特異性發(fā)應(yīng)，室溫孵育1 h。再用PBST洗滌3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1:2500)，室溫?fù)u床孵育60 min。最后用PBST洗滌3次后加入10 mL去離子水溶解的DAB底物顯色反應(yīng)1 min，用去離子水洗滌后烘干拍照。

1.2.5 免疫層析試紙條檢測免疫磁珠納米探針和免疫層析試紙條的制備參考鄭誠等[23]的方法。采用EDC/NHS化學(xué)偶聯(lián)法將Tm的特異性單抗5G5E偶聯(lián)到超順磁性磁性納米微球表面制備免疫磁珠納米探針。然后將60 μg/mL的Tm富集液和2 mg/mL羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜（簡稱NC膜）上，分別作為檢測線T線(Test line)和質(zhì)控線C線(Control line)；再依次將底板、(CN140)、吸水紙、結(jié)合墊、樣品墊和NC膜進行組裝，裁切成0.5 cm寬的試紙條待用。層析檢測時，準(zhǔn)確移取待測樣本105 μL和0.4 μg免疫磁珠、15 μL層析體系（含5%(V/V)Tween-20和2%（w/v）BSA的5 mM硼酸溶液）混合均勻，再緩慢滴加在試紙條的樣品墊處層析15~20 min，肉眼觀察試紙條的T和C線顏色變化。因?qū)游鲈嚰垪l采用的是競爭反應(yīng)原理，因此陰性樣本在T線和C線區(qū)域有明顯的顏色反應(yīng)，而陽性樣本則只有C線有顏色反應(yīng)，T線無顏色反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BCA蛋白定量結(jié)果分析

對8種方法處理提取的樣品進行BCA蛋白定量分析（表2）。由表可見，方法5和方法7的提取液樣品，其蛋白質(zhì)含量最高，同其他方法存在顯著性差異，而方法1~4的提取液樣品中的蛋白質(zhì)含量較少。方法6和8的提取液樣品蛋白質(zhì)含量適中(2.2~2.5 mg/mL)。因為樣品取液中有較高濃度的水溶性蛋白質(zhì)存在，這會改變層析速度，降低層析效果[24]，而蛋白質(zhì)含量太低則意味著目標(biāo)過敏原Tm的含量很低，容易降低層析檢測靈敏度。故此，前處理方法6和8較為適合于免疫層析檢測。

表2 8種不同前處理方法蛋白含量

注：表中不同字母代表同行不同方法中提取蛋白量存在顯著性差異，＜0.05；字母從大到小代表蛋白含量從高到低。

Note: The different letters in the table represent significant differences in the amount of extracted protein in different methods, P<0.05; letters from large to small represent high to low protein content.

2.2 SDS-PAGE蛋白組分結(jié)果分析

8種前處理方法的樣品經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯染色后的結(jié)果如圖1所示。由圖可知，方法1、2、3和4的提取液樣品中Tm目的蛋白（~35kDa）的條帶很淺，表明其含量很少。而方法5、6、7和8的提取液樣品中Tm目的蛋白條帶既粗又寬，表明其含量很高；但是方法5和7樣品在分子量66.2~116 kDa時含有較多的雜蛋白。在層析檢測時，高分子量蛋白質(zhì)容易造成堵塞從而影響檢測結(jié)果。方法6樣品在分子量45 kDa和19 kDa時含有雜蛋白。

因此相較于方法5、6和7，方法8的提取液樣品更為適合于免疫層析檢測。

2.3 Western- blotting分析過敏原組分結(jié)果

圖2是Western- blotting分析過敏原組分的結(jié)果。由圖可知，八種方法提取出的原肌球蛋白都具有免疫活性，但1、2、3、4方法提取的原肌球蛋白反應(yīng)條帶很淺，表明其含量很少，與SDS-PAGE的結(jié)果相符合。方法5和7在分子量110和45 kDa時出現(xiàn)了非特異性反應(yīng)條帶，方法6和8則沒有非特異性反應(yīng)并且Tm目的條帶反應(yīng)很強。由免疫印跡和SDS-PAGE反應(yīng)結(jié)果可以看出，兩處理方法8更適合于免疫層析檢測。

圖1 8種前處理方法的SDS-PAGE分析結(jié)果

圖2 8種前處理方法的過敏原性組分

2.4 免疫層析檢測的應(yīng)用可行性分析

將不同前處理方法制備的樣品滴加到磁性納米探針標(biāo)記的免疫層析試紙條上所得檢測結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，方法1、2、3和4在磁性納米探針標(biāo)記的免疫層析試紙條上呈現(xiàn)假陰性結(jié)果。SDS-PAGE結(jié)果顯示這兩種方法的Tm含量很少，因此我們推測很可能是因為Tm目標(biāo)蛋白含量過低導(dǎo)致試紙條未能檢測出來從而呈現(xiàn)假陰性結(jié)果。5、6和7因在提取的過程中的提取出較多的水溶性雜蛋白，所以在磁性納米探針標(biāo)記的層析試紙條檢測中出現(xiàn)了堵塞現(xiàn)象，從而導(dǎo)致T和C線顏色很淺。方法8的提取液樣品在層析檢測中顯示出正常的陽性結(jié)果。綜合考慮蛋白質(zhì)組分分析結(jié)果，我們認(rèn)為方法8最為適合于免疫層析檢測。

由表3可知，方法1、3、5、7提取時間較短，方法1、2、6、7、8提取所用設(shè)備簡單，易操作，可應(yīng)用于現(xiàn)場操作，但只有方法8可應(yīng)用于磁性納米探針免疫層析試紙條的檢測。綜合以上分析方法8是最好的樣品前處理方法。

表3 8種前處理方法比較

3 結(jié)論

基于磁性納米探針標(biāo)記的免疫層析檢測技術(shù)具有簡便、快速，可肉眼判定等優(yōu)點。但目前提取原肌球蛋白常用的是用硫酸銨的方法，該方法要先制作丙酮粉耗時長操作復(fù)雜，不適宜進行現(xiàn)場快速檢測。本文中不同的Tm樣品前處理方法制備的樣品，在應(yīng)用于磁性納米探針標(biāo)記免疫層析檢測時產(chǎn)生不同的檢測結(jié)果。經(jīng)優(yōu)化和評價，本研究建立了一種適合于層析檢測的蝦類主要過敏原原肌球蛋白的樣品前處理方法：先用丙酮抽提蝦肉至無色，然后按1:5（w/v）的比例加入20 mM Tris-HCl （pH9.2）電動勻漿器勻漿30 s，所得混合液再進行超聲處理10 min后加熱5 min，冷卻后用迷你離心機離心10 min后取上清。該方法耗時短(~30 min)，操作簡便，可滿足現(xiàn)場檢測對前處理的要求，今后可作為免疫層析檢測技術(shù)的配套樣品處理方法進行應(yīng)用，具有較好的應(yīng)用前景。

[1] Gupta RS, Springston EE, Warrier MR,The prevalence,severity,and distribution of childhood food allergy in the United States[J]. Pediatrics, 2011,128(1):9-17

[2] Castellazz AM, Valsecchi C, Caimmi S,. Probiotics and food allergy[J]. Journal of Pediatrics, 2013,39:47

[3] Sicherer SH, Sampson HA. Food allergy: Epidemiology,pathogenesis,diagnosis,and treatment[J]. J Allergy Clin Immunol, 2014,133(2):291-307

[4] 朱黎娜,侯麗英,張盈瑩,等.不同方法提取和處理中華絨螯蟹組織蛋白的過敏原組分分析[J].中國免疫學(xué)雜 志,2014(12):1652-1657

[5] Leung NY, Wai CY, Shu S,. Current immunological and molecular biological perspectives on seafood allergy:A comprehensive review[J]. Clinical Reviews in Allergy & Immunology, 2012,46(3):180-197

[6] Kobayashi Y, Yang T, Yu CT,. Quantification of major allergen parvalbumin in 22 species of fish by SDS–PAGE[J]. Food Chemistry, 2016,194:345-353

[7] Huang RF, Li ZX, Lin H,. Determination of microheterogeneous substitution in shrimp tropomyosin and its effect on IgE-binding capacity[J].European Food Research & Technology, 2014,239(6):941-949

[8] Rosalía A, Galina G,Ibá?ez MD,Sarcoplasmic calcium-binding protein is an EF-hand-type protein identified as a new shrimp allergen[J]. Journal of Allergy & Clinical Immunology, 2009,124(1):114-120

[9] 徐曉巍,崔正權(quán),盧瑛,等基于磁性納米探針的乙肝前S1抗原的快速磁性免疫層析方法的建立[J].生物學(xué)雜 志,2016,33(1):98-103

[10] Hiroyuki KA, Yako K, YukihiroK,. Reduction in IgE reactivity of Pacific mackerel parvalbumin by heat treatment[J]. Food Chemistry, 2016,206:78-84

[11] Cai QF, Wang XC, Liu GM,. Development of a monoclonal antibody-based competitive enzyme linked immunosorbent assay (c-ELISA) for quantification of silver carp parvalbumin[J]. Food Control, 2013,29(1):241-247

[12] Ratanasumawang S, Hagiwara T, Sakiyama T. Effect of Sodium Chloride on the Adsorption of Proteins from Pink Shrimp () onto Stainless Steel Surfaces[J]. Food Science & Technology Research, 2015,21(3):327-331

[13] Wu LS, LinHX, Wang GY,. Comparative Study on the Allergenicity of DifferentExtract Solutions[J]. Journal of Ocean University of China, 2014,13(1):157-162

[14] Yu CJ, Lin YF, Chiang BL,. Proteomics and immunological analysis of a novel shrimp allergen, Pen m 2[J]. The Journal of Immunology, 2003,170(1):445-453

[15] Liu GM, Cheng H, Nesbit JB,. Effects of Boiling on the IgE-Binding Properties of Tropomyosin of Shrimp ()[J]. Journal of Food Science, 2010,75(1):T1-T5

[16] Shen HW, Liu YY, Chen F,. Purification, characterization and immunoreactivity of tropomyosin, the allergen in[J]. Process Biochemistry, 2014,49(10):1747-1756

[17] 張軼群,林洪,李振興,等.蝦過敏原蛋白純化中硫酸銨沉淀法的改進[J].食品與藥品,2008,10(6):50-52

[18] 胡志和,張晴青,吳子健,等.超高壓處理對凡納濱對蝦原肌球蛋白構(gòu)象的影響[J].食品科學(xué),2016,37(23):25-31

[19] Lasekan AO, Nayak B. Effects of buffer additives and thermal processing methods on the solubility of shrimp () proteins and the immunoreactivity of its major allergen[J]. Food Chemistry, 2016,200(1):146-153

[20] AbdelL RAM, Lopata AL, O'hehir RE,. Characterization and de novo, sequencing of snow crab tropomyosin enzymatic peptides by both electrospary ionization and matrix-assisted laser desorption ionization QqToF tandem mass spectrometry[J]. Journal of Mass Spectrometry, 2010,45(4):372-81

[21] 傅玲琳,富舒潔,王彥波,等.凡納對蝦原肌球蛋白硫酸銨沉淀分離純化方法的優(yōu)化[J].食品科學(xué),2017,38(18):187-192

[22] Lu Y, Ohshima T, Ushio H,. Immunological characteristics of monoclonal antibodies against shellfish major allergen tropomyosin[J]. Food Chemistry, 2007,100(3):1093-1096

[23] Zhen C,Wang XC, Lu Y,. Rapid detection of fish major allergen parvalbumin using superparamagnetic nanoparticle-based lateral flow immunoassay[J]. Advanced Materials Research, 2010,311-313(11):436-445

[24] 方國鋒,王錫昌,梁田田,等.基于免疫層析檢測的河豚毒素快速樣品前處理方法研究[J].生物學(xué)雜志,2017,34(1):94-97

A Rapid and Simple Method Pretreating Samples offor Detecting Major Allergens

LIN Xin1, LIANG Tian-tian1, LU Ying1,2,3*

1.201306,2.201306,3.()201306,

We designed eight pretreatment methodsto develop the sample pretreatment method suitable for rapid detection of primary allergen tropomyosin ofmajor allergen tropomyosin (Tm) ofby the test strip method, the application feasibility of eight pretreatment methods was compared and analyzed byBCA Protein Assay Kit, SDS-PAGE, Western Blot, and magnetic immunoblotting chromatographic test. As a result, it was found that the sample prepared by the eighth method had a moderate protein concentration (2.5 mg/mL), less miscrine proteinand less immunochromatography detection interference of the magnetic nano-probe mark，this is suitable for field rapid detection. The optimized sample pretreatment method of shrimp allergen Tm was as follows: the shrimp was extracted with acetone until colorless, 20 mM Tris-HCl (pH9.2) homogenate was added for 30s, ultrasonic treatment for 10min and heated for 5 min. After cooling, it was centrifuged by mini centrifuge for 10 min, the supernatant was the sample.

Tropomyosin(Tm);;pretreatment

Q81

A

1000-2324(2019)05-0796-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.05.012

2018-02-28

2018-03-28

上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目(滬農(nóng)科攻字(2016)第4-4號)

林昕(1990-),女,碩士研究生.研究方向為水產(chǎn)品過敏原的檢測. E-mail:2273662895@qq.com

Author for correspondence. E-mail:y-lu@shou.edu.cn