張黎麗,張閣,王欣藝,杜安琪,李金寶,常允康,徐娜

土壤中降解有機磷微生物的篩選

張黎麗,張閣,王欣藝,杜安琪,李金寶,常允康,徐娜*

濟寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院, 山東 日照 276800

利用蒙金娜培養(yǎng)基從土壤中篩選出具有明顯解磷能力的微生物，通過鉬銻抗比色法對其解磷活性進行測定，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標(biāo)測定、16S rDNA基因測序三個方面結(jié)果對菌株進行鑒定。結(jié)果表明：成功分離出3株具有明顯解磷能力的細(xì)菌，分別為蠟狀芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌，其溶磷量分別為54.51 mg/L、60.67 mg/L、67.52 mg/L，3者的溶磷能力均較好，以陰溝腸桿菌的解磷能力最強，具備較高的應(yīng)用價值，為進一步研究微生物肥料及微生物降解有機磷農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)。

有機磷降解菌; 鉬銻抗比色法; 16S rDNA

磷元素是植物生長所需的主要營養(yǎng)元素之一，其不僅能促進植物體內(nèi)碳水化合物的運送和轉(zhuǎn)化，同時也是植物固氮所不可缺少的元素[1]。為提高農(nóng)作物產(chǎn)量，人們長期大量施用磷肥，然而肥料中70%以上的水溶性磷與鐵、鋁等離子結(jié)合，形成難溶性磷酸鹽，難以被植物利用[2]。因此，植物對土壤中的大部分磷元素利用率很低。而解磷菌則可以將植物難吸收利用的磷轉(zhuǎn)化成可利用的磷，解磷菌分為無機磷降解菌和有機磷降解菌[3]。無機磷降解菌主要是通過生命活動中所產(chǎn)生的酸，將難溶的無機磷化物（磷酸鈣、磷灰石等）轉(zhuǎn)化為可溶狀態(tài)；而有機磷降解菌則通過分泌磷酸酶、植酸酶、核酸酶等有機磷降解酶，將土壤中難溶的有機磷化物（核酸、磷脂、農(nóng)藥等）降解為可溶性的小分子，為植物提供更多的磷源，從而促進植物生長發(fā)育[4]。

本研究擬從土壤中篩選具有明顯溶磷效果的有機磷降解菌，對其解磷能力進行評估，并結(jié)合其形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)及16S rDNA基因測序三個方面對菌株進行鑒定，為微生物肥料和微生物降解有機磷農(nóng)藥的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土壤樣品土壤樣品采集于日照某田地小麥根周和根際。采樣深度為5~10 cm。

1.1.2 主要培養(yǎng)基有機磷液體培養(yǎng)基：在蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基[5]的基礎(chǔ)上，待培養(yǎng)基溫度降至50 °C左右，馬上加入蛋黃卵磷脂溶液(50 g/L)，每100 mL培養(yǎng)基加入1 mL作為有機磷源，混勻后使用。

1.1.3 鉬銻抗比色法主要試劑磷標(biāo)準(zhǔn)貯存溶液、鉬銻抗貯存液、鉬銻抗顯色劑及指示劑的配制方法參照鉬銻抗比色法[6]。

1.2 實驗方法

1.2.1 解磷菌株的分離與篩選稱取土壤樣品1 g于試管中，加入9 mL無菌水，用移液槍吹打混勻，靜止放置5 min左右。吸取1 mL的懸液到99 mL的蒙金娜液體培養(yǎng)基中，180 rpm，30 °C，震蕩培養(yǎng)72 h。取1 mL上述發(fā)酵液，于裝有9 mL無菌水的試管中，吹打混勻，稀釋涂布于蒙金娜固體培養(yǎng)基上，30 °C靜置培養(yǎng)1~2 d。挑取平板上的菌落，于有機磷固體培養(yǎng)基進行重復(fù)劃線分離，挑選能在蒙金娜平板上穩(wěn)定生長的、有溶磷圈的菌株作為下一步研究對象。

1.2.2 解磷菌菌落特征的觀察將篩選后的解磷細(xì)菌于蒙金娜固體培養(yǎng)基上，30 °C，靜置培養(yǎng)3 d。觀察并記錄單菌落特征。

1.2.3 解磷微生物的解磷活性測定磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和樣品磷含量的測定方法參照鉬銻抗比色法[6]。

結(jié)果計算：如公式所示。= 稀釋倍數(shù) ×

式中：- 溶磷量，可溶性磷含量，mg/L；- 標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出的可溶性磷含量，mg/L；

- 溶磷率，可溶性磷含量占總磷含量的百分比；- 培養(yǎng)液中加入的有機磷物質(zhì)的質(zhì)量，mg/L。

1.2.4 生理生化試驗參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[8]的方法，對篩選得到的解磷菌進行葡萄糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、甘露醇發(fā)酵、硫化氫產(chǎn)生、過氧化氫酶、MR、VP、檸檬酸鹽利用、淀粉水解試驗及抗生素敏感性試驗。

1.2.5 分子鑒定使用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取篩選得到的解磷菌的基因組DNA，并利用細(xì)菌通用引物27F和1387R，擴增其16S rDNA。PCR反應(yīng)條件為：94 °C 5 min，94 °C 1 min，55 °C 1 min，72 °C 2 min，72 °C 10 min，35個循環(huán)。所得產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司天津公司進行測序。測序所得的16S rDNA基因序列在NCBI上進行Blast分析比對，MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌株的篩選

利用蒙金娜固體培養(yǎng)基，通過劃線分離的方法，經(jīng)過三次反復(fù)劃線培養(yǎng)，篩選出5株能在蒙金娜培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長的菌株，但只有3株具有降解有機磷的能力，菌株JP-1、JP-2及BP-1菌具有明顯溶磷圈，選擇這3株菌作為研究對象（見圖1）。

圖1 有機磷降解菌的菌落形態(tài)

注：菌株1-5分別命名為JP-1、JP-2、JP-3、JP-4、BP-1。

Note: strains 1-5 were named as JP-1, JP-2, JP-3, JP-4, BP-1, respectively.

2.2 菌落特征觀察

通過菌落特征，初步判斷3株菌均為細(xì)菌。（見表1）

表1 菌株JP-1、JP-2、BP-1的菌落特征

2.3 解磷微生物的解磷活性測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線：= 0.5841+ 0.0046，2= 0.9959。

3株菌溶磷量分別可達54.51 mg/L、60.67 mg/L、67.52mg/L，結(jié)合圖1中3株菌的溶磷圈大小，可以看出這3株菌對有機磷的降解能力較強（見表2）。

表2 菌株JP-1、JP-2、BP-1的溶磷活性

注：a, b, c表示差異顯著（＜0.05）。

Note: a, b, c indicate a significant difference (<0.05).

3 結(jié)果與分析

3.1 株菌的生理生化測定結(jié)果及抗生素敏感性試驗

表3 菌株JP-1、JP-2、BP-1的生理生化特征

注：“+”表示陽性，“－”表示陰性；1-10分別代表葡萄糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、甘露醇發(fā)酵、硫化氫產(chǎn)生、過氧化氫酶、MR、V-P、檸檬酸鹽利用、淀粉水解試驗

Note: + represents positive. – represents negative. Numbers 1-10 represent the tests of glucose ferment, lactose ferment, sucrose ferment, mannose ferment, hydrogen sulfide production, catalase, MR, V-P, citrate utilization and starch hydrolysis, respectively.

表4 菌株JP-1、JP-2、BP-1的抗生素敏感性試驗

注：“+”表示陽性，“－”表示陰性； 1-8分別代表克林霉素、多粘菌素B、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素、氯霉素、萬古霉素、青霉素。

Note: + represents positive. – represents negative. Numbers 1-8 represent test of clindamycin, polymyxin B, tctracyclin, erthromycin, gentamycin, chloromycctin, vancomycin and penicillin.

3.2 分子鑒定

圖2 基因組DNA的電泳結(jié)果

圖3 菌株JP-1、JP-2、BP-1的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

3.2.1 基因組DNA提取與檢測利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取3株菌的基因組DNA，所提取DNA條帶明亮清晰（見圖2）。

3.2.2 16S rDNA序列擴增結(jié)果以提取的基因組DNA為模板，使用細(xì)菌通用引物27F和1387R進行PCR擴增，條帶為1500 bp左右，與目的條帶大小一致，且條帶明亮清晰（見圖3）。

3.2.3 序列比對及進化樹構(gòu)建將上述PCR擴增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。將所得基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖4所示，JP-1與Bacillus cereus的遺傳進化距離最近，序列比對顯示二者16SrDNA序列相似度為100%；JP-2與Klebsiella pneumoniae的遺傳進化距離最近，二者16S rDNA序列相似度為100%；BP-1與Enterobacter cloacae的遺傳進化距離最近，二者16S rDNA序列相似度為99.61%。結(jié)合生理生化試驗，3株菌分別為蠟狀芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌。

圖4 菌株JP-1、JP-2、BP-1的系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

通過溶磷圈和溶磷量測定實驗可知，3株菌均具有較強的降解有機磷的能力。其中，經(jīng)鑒定為陰溝腸桿菌的BP-1菌株的解磷能力最強，肺炎克雷伯氏菌（JP-2）和蠟狀芽孢桿菌（JP-1）次之。

研究表明，蠟狀芽孢桿菌不僅能夠促進作物成熟、生長[9]，還可顯著的防治根癌病的發(fā)生[10]。肺炎克雷伯氏菌，不僅具有解磷能力，而且還具有固氮，鐵載體的功能，對植物的生長有很大的促進作用[11,12]；而陰溝腸桿菌的解磷能力不僅體現(xiàn)在對土壤有機磷的降解上，更重要的是對有機磷農(nóng)藥有較好的降解能力，且其生存能力強[13]。因此，本研究篩選所得的3株菌在微生物肥料及農(nóng)藥降解方面具備較高的應(yīng)用價值，為微生物肥料的開發(fā)利用以及農(nóng)藥的微生物降解奠定了基礎(chǔ)。

5 結(jié)論

利用蒙金娜培養(yǎng)基篩選出有明顯溶磷圈，即有溶磷活性的3株菌株（JP-1、JP-2、BP-1）。采用鉬銻抗比色法對3株菌的溶磷活性進行測定，其溶磷量分別可達54.51 mg/L、60.67 mg/L、67.52 mg/L，溶磷活性較好。經(jīng)分子鑒定，結(jié)合生理生化試驗結(jié)果，3株菌分別為蠟狀芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌。

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Screening of Strains for Organophosphorus-degradation in Soil

ZHANG Li-li, ZHANG Ge, WANG Xin-yi, DU An-qi, LI Jin-bao, CHANG Yun-kang, XU Na*

276800,

We used Monjina medium to screen microorganisms with obvious ability to decompose phosphorus from the soil, then determined its phosphorus solubilization activity of the strain by Mo-Sb antispetrophotography method and identified the strains by morphological observation, physiological and biochemical indexes determination and 16S rDNA gene sequencing. Results showed three strains with obvious phosphorus - solubilizing ability were identified as Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae and Enterobacter cloacae, the dissolved phosphorus content was 54.51 mg/L, 60.67 mg/L and 67.52mg/L, respectively, the phosphorus dissolving ability of enterobacter cloacae was the strongest, which was of high application value, our study can contribute to the further research of microbial fertilizer and the microbial degradation of the organophosphorus pesticide.

Organophosphorus-degradation bacteria; Mo-Sb antispetrophotography method; 16S rDNA

Q939.9

A

1000-2324(2019)05-0774-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.05.008

2018-07-28

2018-09-02

國家自然科學(xué)基金(31700211);省自然科學(xué)基金(ZR2017BC081);國家重點實驗室開放項目(2017KF08);大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃(cx2019096);大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃(cx2019044)

張黎麗(1987-),女,碩士,研究方向為生物資源與環(huán)境. E-mail:skyxsh24@163.com

Author for correspondence. E-mail:xuna828@163.com