鄧浩輝，李曉強(qiáng)，高洪波，陳偉烈

由于感染途徑的差異，人類免疫缺陷病毒（HIV）/丙型肝炎病毒（HCV）混合感染與HCV感染者的HCV基因型分布可能并不一致。本研究應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)廣州地區(qū)HIV/HCV混合感染者與HCV感染者感染HCV基因型進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2012年～2016年廣州市第八人民醫(yī)院門(mén)診或住院的HIV/HCV混合感染者和HCV感染者被納入研究。HCV感染的診斷符合2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)發(fā)布的《慢性丙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，HIV感染的診斷符合2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)艾滋病學(xué)組發(fā)布的《艾滋病診療指南第三版》[2]。排除標(biāo)準(zhǔn)：混合其他病毒性肝炎、酒精性肝病、脂肪肝、藥物性肝損傷和自身免疫性肝炎，排除既往曾使用過(guò)抗病毒藥物治療的慢性丙型肝炎（CHC）患者，排除血清HCV載量在檢測(cè)線以下的患者。所有入選對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，本項(xiàng)目已通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查。

1.2 HCV基因分型檢測(cè) 使用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kits試劑盒（Takara，大連）提取血清HCV RNA。使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Takara，大連）和 HCV特異引物（HCV RT：5'-GGRGCDGARTACCTRGTCAT-3'，nt 8693-8712，JFH-1，AB047639） 行逆轉(zhuǎn)錄。使用HCV Core和NS5B基因片段行HCV基因分型。HCV core基因片段產(chǎn)物為401bp，擴(kuò)增引物為 ：外引物：F15'-TGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGC-3'，R15'-GGATGTACCCCATGAGGTCGGC-3'；內(nèi)引物 ：F25'-TCGTAGACCGTGCATCATGAGCAC-3'，5'-R2：CCGCAYGTRAGGGTATCGATGAC-3'。HCV NS5B基因片段產(chǎn)物為375bp，擴(kuò)增引物參考文獻(xiàn)報(bào)道[3]。本研究在內(nèi)引物的5'端加入6個(gè)已知序列的隨機(jī)堿基（barcode），分離各樣本測(cè)序數(shù)據(jù)。使用PrimeSTAR高保真酶（Takara，大連）擴(kuò)增HCV Core和NS5B基因片段，第一輪反應(yīng)條件如下：95°C 預(yù)變性 3 min；95°C變性 15 s，55°C退火5 s，72°C延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72°C再延伸3 min。第二輪反應(yīng)條件如下：95°C預(yù)變性 3 min；95°C 變性 15 s，55°C 退火 5 s，72°C延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72°C 再延伸3 min。為評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄、PCR和測(cè)序過(guò)程中引入的錯(cuò)誤，我們使用了包含HCV Core和NS5B基因片段的質(zhì)粒（HCV 6a型），將其體外轉(zhuǎn)錄為RNA（T7 High Yield RNA Transcription Kit，諾唯贊，南京），與檢測(cè)標(biāo)本同步行逆轉(zhuǎn)錄、PCR和測(cè)序。對(duì)PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用Image J軟件對(duì)其進(jìn)行灰度值計(jì)算，相近灰度值的樣本歸類為同一分組進(jìn)行混樣（10～15個(gè)樣本為同一組），對(duì)混樣的樣本使用Takara公司的膠回收試劑盒進(jìn)行回收，對(duì)回收產(chǎn)物使用Nanodrop2000核酸定量分析儀定量，取每樣本DNA 30 ng送上海美吉生物公司測(cè)序，建庫(kù)試劑盒為NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，美國(guó)），測(cè)序儀為 Illumina Miseq，測(cè)序模式為PE300。應(yīng)用 FASTX Toolkit軟件的FASTQ Quality Filter組件過(guò)濾原始數(shù)據(jù)，剔除低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的reads（Q30＜80%）。應(yīng)用Geneious R10.0.5軟件對(duì)過(guò)濾后的原始文件與HCV參考序列比對(duì)，剔除非HCV序列。應(yīng)用Geneious R10.0.5軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)3'端序列行末端修剪，將末端允許錯(cuò)誤率的閾值設(shè)置為小于1%。然后，根據(jù)預(yù)設(shè)的barcode對(duì)各樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分離。應(yīng)用FLASH V1.2.9程序?qū)π蛄羞M(jìn)行拼接[4]。應(yīng)用Geneious R10.0.5軟件對(duì)拼接后的樣本過(guò)濾長(zhǎng)度大于或小于目的片段的序列。根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]，從NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)下載廣東地區(qū)常見(jiàn)的HCV基因型的參考序列，具體如下：HCV 1a（AB520610、EU781824），HCV 1b（D10934、L02836），HC V2a（D00944、AF238482），HCV 3a（AF046866、D17763），HCV 3b（D49374）和 HCV 6a（AY859526、Y12083）。應(yīng)用 Geneious R10.0.5 軟件的“Map to reference”組件對(duì)HCV Core和NS5B基因片段測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)多序列比對(duì)，軟件參數(shù)如下：靈敏度設(shè)置為自定義靈敏度（custom sensitivity），每條read最大錯(cuò)配率設(shè)置為10%。對(duì)HCV Core和NS5B二代測(cè)序數(shù)據(jù)均提示存在混合基因型可能的樣本（參考二代測(cè)序的錯(cuò)誤率[5]和本研究質(zhì)粒片段分型的錯(cuò)誤率，即超過(guò)該樣本1%以上的reads比對(duì)至其他基因型的樣本），應(yīng)用HCV NS5A基因型特異引物（in-house引物）再次進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證HCV混合基因型的存在。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)本研究獲得的呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，對(duì)偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距，IQR）表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（%）表示。應(yīng)用SPSS 13.0軟件分別行t檢驗(yàn)、Mann-Whitney U檢驗(yàn)、x2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法計(jì)算，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均取雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HCV感染者一般資料 在納入的233例HCV感染者中，HIV/HCV混合感染者與HCV感染者性別、年齡、血清ALT水平和HCV RNA載量方面比較，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；HIV/HCV 混合感染者靜脈吸毒構(gòu)成比顯著高于HCV感染者（P＜0.001）；HCV感染者輸血感染的構(gòu)成比顯著高于HIV/HCV混合感染者（P＜0.001，表1）。

表1 HIV/HCV混合感染和HCV感染者一般資料【%，（±s），M（IQR）】 比較

表1 HIV/HCV混合感染和HCV感染者一般資料【%，（±s），M（IQR）】 比較

HIV/HCV混合感染（n=95） HCV感染（n=138） P性別（男 /女） 84（88.4）/11（11.6） 114（82.6）/24（17.4） 0.222年齡（歲） 43.0（36.0～53.0） 43.0（35.0～49.0） 0.442 CD4細(xì)胞（個(gè)/mm3） 253（123.0～410.0） 無(wú)數(shù)據(jù) -血清 ALT水平（u/l） 74.2±85.8 75.2±72.0 0.925 HCVRNA（lgcopies/ml） 6.3±0.7 6.4±0.8 0.353 HCV感染危險(xiǎn)行為靜脈吸毒 74（77.9） 27（19.6） ＜0.001未保護(hù)性性行為 14（14.7） 10（7.2） 0.093輸血 3（3.2） 67（48.6） ＜0.001其他/未知 4（4.2） 34（24.6） -

2.2 二代測(cè)序錯(cuò)誤發(fā)生情況 為評(píng)估二代測(cè)序的錯(cuò)誤發(fā)生情況，應(yīng)用HCV質(zhì)粒Core和NS5B基因片段行二代測(cè)序，結(jié)果Core基因片段數(shù)據(jù)量為20520 reads，NS5B基因片段數(shù)據(jù)量為18752 reads。序列比對(duì)結(jié)果提示Core基因片段20400 reads（99.4%）為HCV 6a基因型，NS5B基因片段18672 reads（99.6%）為 HCV 6a基因型。參考既往研究的二代測(cè)序錯(cuò)誤發(fā)生率和本研究質(zhì)粒測(cè)序的錯(cuò)誤率，本研究定義1%以上的reads比對(duì)至其他HCV基因型為存在混合基因型感染的可能。

2.3 兩組HCV感染者病毒基因測(cè)序數(shù)據(jù)量的比較 HIV/HCV混合感染者HCV Core基因片段測(cè)序的數(shù)據(jù)量為（15456±6689）reads，HCV感染者為（14323±5321） reads（P>0.05）；HIV/HCV 混合感染者HCVNS5B基因片段平均數(shù)據(jù)量為（16432±3467） reads，HCV 感染者平均數(shù)據(jù)量為（17611±5632） reads（P>0.05）。

2.4 兩組HCV基因型比較 在本研究納入的233例HCV感染者中，228例（97.9%）為HCV單一基因型感染，5例（2.1%）為HCV混合基因型感染者，其中HIV/HCV混合感染者4例（4.2%，1b型/6a型1例，1b型/3b型2例，3b/6a 1例），HCV感染者1例（0.7%，為2a/6a型）。兩組HCV感染者混合基因型構(gòu)成比無(wú)顯著差異（P=0.071）。HIV/HCV混合感染者感染HCV 6a型和3b型者顯著高于HCV感染者（P=0.001，P=0.005），而感染 HCV 1b型者顯著低于單一 HCV感染者（P＜0.001，表2）。

表2 HIV/HCV混合感染者與HCV感染者HCV基因型（%）比較

3 討論

根據(jù)Simmonds分型方法和目前文獻(xiàn)的報(bào)道，HCV可分為7個(gè)基因型和多個(gè)基因亞型[6，7]。HCV分型方法包括基因型特異引物和探針PCR擴(kuò)增、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析[8]、反向雜交線性探針技術(shù)（INNO-LiPA法）[9]和測(cè)序法，其中測(cè)序法為分型的金標(biāo)準(zhǔn)，包括直接測(cè)序法和二代測(cè)序。直接測(cè)序法僅能檢測(cè)HCV主要的基因型，二代測(cè)序具有高靈敏度的特點(diǎn)，能準(zhǔn)確對(duì)HCV分型并檢測(cè)HCV混合基因型感染的存在[10，11]。

本研究納入廣州地區(qū)233例HCV感染者，包括HIV/HCV混合感染者和HCV感染者，以二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行HCV基因檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣州地區(qū)HIV/HCV混合感染者HCV基因型以HCV 6a型為主，HCV 3b和6a型的構(gòu)成比顯著高于HCV感染者，而HCV感染者以1b型為主，HCV 1b型的構(gòu)成比顯著高于HIV/HCV混合感染者。另外，在233例HCV感染者中，發(fā)現(xiàn)5例患者存在HCV混合基因型感染，其中4例為HIV/HCV混合感染者，1例為HCV感染者。

HCV基因型在國(guó)內(nèi)以1b和2a型為主，其分布在不同地區(qū)并不一致，如西南地區(qū)HCV 3b型的流行明顯高于其他地區(qū)，中國(guó)南方地區(qū)HCV 3型和6型的比例高于全國(guó)的平均水平[12]。既往研究表明HCV基因型的分布與HCV感染途徑明顯相關(guān)[13-15]。在本組HIV/HCV混合感染者中，主要的HCV感染途徑為靜脈吸毒，而HCV感染者主要的感染途徑為輸血。因此，HIV/HCV混合感染者3b和6a基因型構(gòu)成比顯著高于HCV感染者，可能與感染途徑不同有關(guān)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HCV 3型感染者對(duì)直接抗病毒藥物（DAAs）治療的應(yīng)答較差，而在HIV/HCV混合感染者中，HCV 3b型的構(gòu)成比較高，應(yīng)予重視。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究結(jié)果表明，HCV感染者存在HCV混合基因型感染的現(xiàn)象。過(guò)去本地區(qū)報(bào)道的研究?jī)H采用靈敏度較低的方法進(jìn)行HCV基因型分型，難以發(fā)現(xiàn)HCV混合基因型的存在。本研究使用二代測(cè)序?qū)Ρ镜貐^(qū)HCV基因型進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5例患者存在HCV混合基因型感染，且5例患者的感染危險(xiǎn)途徑均為靜脈吸毒，推測(cè)靜脈吸毒者多次使用不潔注射器，可能是導(dǎo)致不同HCV基因型混合感染的原因。