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        多位點(diǎn)序列分析方法在克羅諾桿菌屬菌株溯源分析上的應(yīng)用

        2019-11-07 07:12:26閆瑞楊捷琳陳翠玲鈕冰徐之雯蔣原
        中國(guó)乳品工業(yè) 2019年9期
        關(guān)鍵詞:分析

        閆瑞,楊捷琳,陳翠玲,鈕冰,徐之雯,蔣原

        (1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444;2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局,上海 200135)

        0 引言

        克諾羅桿菌原為阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii),隸屬于腸桿菌科[1-2]。克羅諾桿菌屬(Cronobacter spp.)現(xiàn)包括7個(gè)種和3個(gè)亞種[1-3],屬內(nèi)菌株不同分型種類與臨床相關(guān)性存在較大差異,其中多數(shù)臨床分離株為阪崎克羅諾桿菌(C.sakazakii)和丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌(C.malonaticus)。據(jù)報(bào)道,多數(shù)菌株易感染嬰幼兒和老年人等免疫力低下人群,可導(dǎo)致嚴(yán)重疾?。▔乃佬孕∧c結(jié)腸炎、敗血癥和腦膜炎),且致死率非常高(40%~80%)[4-6]。隨著克羅諾桿菌在不同食品尤其是嬰幼兒配方粉中被檢出而受到食品和衛(wèi)生監(jiān)管部門的高度重視[7,8]。

        盡管人們已從食品、環(huán)境和臨床上分離到大量菌株,也對(duì)其分類有了較為清晰的認(rèn)識(shí)。但是隨著越來(lái)越多克羅諾桿菌全基因組測(cè)序的完成,研究發(fā)現(xiàn)過(guò)去基于單個(gè)或多個(gè)基因的分型方法由于納入分析的信息有限,誤將許多無(wú)關(guān)菌株劃分到了一起[9,10]。因此利用全基因組測(cè)序(W hole genome sequencing,WGS)獲得的基因組數(shù)據(jù),采用合適的分型方法來(lái)準(zhǔn)確鑒定和快速識(shí)別不同來(lái)源的克羅諾桿菌能夠更為精確的將菌株進(jìn)行分類,全基因組所提供的信息量在分類學(xué)中就顯得尤為重要。目前,已有許多方法可以分析全基因組測(cè)序數(shù)據(jù),常用的3種方法[11]包括:基于k-m er統(tǒng)計(jì)的分析方法,單核苷酸多態(tài)性分析(Single nucleotide po ly-m orphism s,SNP)以及基于W GS的擴(kuò)展的多位點(diǎn)序列分型方法即全基因組MLST。其中全基因組MLST具有較高的流行病學(xué)一致性、穩(wěn)定的菌株命名法和完善的數(shù)據(jù)庫(kù),能夠?qū)崿F(xiàn)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化和可擴(kuò)展性,分析速度快、辨識(shí)度高,計(jì)算要求復(fù)雜度低且相較于另外兩種分析方法無(wú)需生物信息專業(yè)知識(shí)。正是由于全基因組MLST具備上述諸多優(yōu)勢(shì),使其成為國(guó)際食源性疾病監(jiān)測(cè)分子分型網(wǎng)絡(luò)(PulseN et International,http://www.pu lsenetinternational.org/)標(biāo)準(zhǔn)化監(jiān)測(cè)的技術(shù)基礎(chǔ)[11-12]。

        本研究中所采用的擴(kuò)展的多位點(diǎn)序列分型方法是由Forsythe等[9]人建立的cogMLST分析方案,該方案主要是以C.sakazakii ES15菌株的直系同源基因簇作為參考基因組所定義的1865個(gè)基因座為基礎(chǔ)進(jìn)行基因組序列比對(duì)分析,可以跨屬或選擇特定的物種或菌株進(jìn)行比較。2014年Forsythe等[9]通過(guò)采用更具辨別力的編碼核糖體蛋白基因的多位點(diǎn)序列分析(ribosom al-MLST,rM LST)和基于直系同源基因簇核心基因的多位點(diǎn)序列(C lusters o f O rtho logous Genes-core geneM LST,COG-cgM LST)分析方法對(duì)107個(gè)克羅諾桿菌全基因組數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步證明C.sakazakii CC 4克隆譜系非常穩(wěn)健。現(xiàn)在cogMLST可通過(guò)克羅諾桿菌PubM LST數(shù)據(jù)庫(kù)在線進(jìn)行全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析。

        1 材料與方法

        1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

        克羅諾桿菌屬菌株信息收集自http://pubm lst.org/cronobacter/,通 過(guò) Cronobacter Pub MLST門戶網(wǎng)站https://pubm lst.org/bigsdb?db=pubm lst_cronobacter_isolates,點(diǎn)擊查詢/瀏覽數(shù)據(jù)庫(kù)(Search or brow se database)選項(xiàng)下的基于7個(gè)位點(diǎn)的MLST方案獲取克羅諾桿菌的序列類型并將所有菌株來(lái)源信息以Excel文件格式導(dǎo)出,后通過(guò)Excel工作表中的數(shù)據(jù)篩選功能對(duì)菌株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        本研究中使用的菌株信息均來(lái)自C ronobacter Pub MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中的2 438株克羅諾桿菌屬菌株,包括阪崎克羅諾桿菌ST 1(67株),ST 4(95株),ST 13(43株)和丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌ST 7(35株),具體信息見(jiàn)表1。表2列出了阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌中主要序列類型的國(guó)家來(lái)源概況。

        1.2 建立本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)

        全基因組序列分析所需的240株菌株DNA序列收集自http://pubm lst.org/cronobacter/,通過(guò)C ronobacter PubM LST門戶網(wǎng)站上的選項(xiàng)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析,可訪問(wèn):https://pubm lst.org/bigsdb?db=pubm lst_cronobacter_isolates。瀏覽并選取已完成全基因組測(cè)序的菌株以FASTA文件格式導(dǎo)出菌株的DNA序列信息。

        1.3 7-loci MLST

        菌株(2 400多株)的序列類型和克隆譜系通過(guò)Cronobacter Pub-MLST(https://pubmlst.org/cronobacter/)的在線工具進(jìn)行確定,訪問(wèn)該網(wǎng)站并選擇序列比對(duì)(Sequence query)選項(xiàng)下的MLST方案即獲得相應(yīng)的等位基因編號(hào),ST和CC等比對(duì)信息。

        1.4 cog MLST分析

        首先通過(guò)Cronobacter Pub MLST(https://pubmlst.org/bigsdb db=pubmlst_cronobacter_isolates)當(dāng)中的“分析”(Analysis)選項(xiàng)下的基因組比較(Genome Comparator)選項(xiàng)進(jìn)行提交所需分析菌株的完整DNA序列,后選用cog MLST方案依次重復(fù)獲取阪崎克羅諾桿菌ST1(67株),ST4(95株),ST 13(43株)和丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌ST7(35株)菌株基因組的距離矩陣。矩陣以nexus文件格式導(dǎo)出并使用SplitsTree 4中的默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行分析(UncorrectedP用于計(jì)算距離,并通過(guò)Neighbor Net構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖譜)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 克羅諾桿菌屬菌株統(tǒng)計(jì)結(jié)果

        目前Cronobacter Pub MLST基因組和序列定義數(shù)據(jù) 庫(kù)(http://pubmlst.org/cronobacter/)已 包 含 超 過(guò)2400多株菌株分離信息,其中C.sakazakii(1 774株)和C.malonaticus(295株)為該屬的優(yōu)勢(shì)菌種(表1)。通過(guò)將7-loci MLST應(yīng)用于2 438株菌進(jìn)行分析,共揭示了591種可定義的序列型(sequence type,ST),其中克諾羅桿菌C.sakazakii ST1(280株)、ST 4(334株)、ST 13(67株)和C.malonaticus ST7(78株)為主要序列型(表2)。截止2019年3月20日,數(shù)據(jù)庫(kù)中已有623株菌完成全基因組測(cè)序,包括C.sakazakii(438株)、C.malonaticus(82株)、C.dublinensis(56株)、C.turicensis(23株)、C.muytjensii(13株)C.universalis(9株)和C.condimenti(2株)。數(shù)據(jù)庫(kù)中最早的分離株為1950年分離自英國(guó)奶粉中的C.sakazakii,所有菌株共分離自全球40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。多數(shù)菌株分離自食品及配料當(dāng)中,C.sakazakii和C.malonaticus與臨床及嬰幼兒配方奶粉密切相關(guān)。C.sakazaki i和C.malonaticus中主要序列類型的國(guó)家來(lái)源統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,多數(shù)菌株分離自中國(guó)和美國(guó)(表1、2)。上述結(jié)果表明,由于MLST所針對(duì)的七個(gè)基因位點(diǎn)在基因組總量中占比較小,導(dǎo)致同一ST型中包含地理來(lái)源,分離時(shí)間,宿主等不相關(guān)的菌株,而對(duì)菌株溯源結(jié)果適得其反。

        表1 Cronobacter Pub MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中的克羅諾桿菌菌株統(tǒng)計(jì)

        2.2 C.sakazakii ST 1菌株的cog MLST分析

        如圖1所示,67株阪崎克羅諾桿菌ST 1菌株的cog MLST聚類分析結(jié)果顯示,多數(shù)ST 1菌株基因組存在較大差異,22株于2014年分離自美國(guó)威斯康星州環(huán)境中的菌株聚集到了一起。值得注意的是,同樣分離自于2014年分離自美國(guó)俄勒岡州環(huán)境中的兩株菌(編號(hào)1344和1361)形成了另一分枝。67株ST 1菌株中最早的分離株(編號(hào)2522)在1987年分離自丹麥臨床當(dāng)中與兩株分別源自愛(ài)爾蘭和加拿大臨床的菌株(編號(hào)1912和2536)聚集到了一起。兩株最新于2017年分離自丹麥臨床的菌株(編號(hào)2521和2573)卻與最早分離株(編號(hào)2522)存在較大差異。這些結(jié)果表明,阪崎克羅諾桿菌ST 1菌株的cogMLST聚類與菌株來(lái)源之間存在密切相關(guān)性。

        2.3 C.sakazakii ST 4菌株的cog MLST分析

        通過(guò)將cog MLST方案應(yīng)用于95株阪崎克羅諾桿菌ST4菌株進(jìn)行全基因組分析,結(jié)果如圖2所示,2014年分離自法國(guó)臨床及嬰幼兒配方奶粉的15株菌都聚集到了一起,3株源自2009年美國(guó)臨床的菌株(編號(hào)121、1163和1315)形成了一個(gè)單獨(dú)分枝。此外,一株于1997分離自年荷蘭臨床的菌株(編號(hào)1104)與另一株于2009年分離自瑞士臨床的菌株(編號(hào)2539)聚集到了一起。另外,最早于1950年分離自英國(guó)奶粉 的兩株菌則未與其它分離菌株形成明顯聚類。95株阪崎克羅諾桿菌ST 4菌株的cogMLST聚類分析結(jié)果表明,相同序列型菌株包含了大量非相關(guān)菌株,聚類與菌株來(lái)源之間存在一定關(guān)聯(lián)。

        表2 C.sakazakii和C.malonaticus中主要序列類型的國(guó)家來(lái)源概況

        圖1 C.sakazakii ST1菌株的cog MLST分析

        圖2 C.sakazakii ST4菌株的cogMLST分析

        2.4 C.sakazakii ST13菌株的cogMLST分析

        如圖3所示,通過(guò)Cronobacter Pub MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中的cog MLST方案對(duì)43株阪崎克羅諾桿菌ST 13菌株分析顯示,在2005至2006年分離自中國(guó)進(jìn)口乳制品當(dāng)中的31株菌聚集到了一起,盡管這些乳品進(jìn)口自6個(gè)不同的國(guó)家。這一結(jié)果與先前Guo等[13]人的SNP分析結(jié)果相一致——大多數(shù)菌株的SNP位點(diǎn)差異在20以內(nèi),因而可推測(cè)這些菌株存在克隆關(guān)系。值得注意的是,在Guo等[13]人的研究中的菌株CS-71(編號(hào)1999)因與參考菌株存在5387個(gè)SNP位點(diǎn)差異而與其它31株菌的基因組明顯不同。在此次研究當(dāng)中,菌株CS-71也相對(duì)于高度克隆的31株菌形成了一個(gè)單獨(dú)分枝,并且與2016年分離自比利時(shí)臨床的菌株(編號(hào)2505)在基因組層面更為接近。此外,5株在1994年分離自法國(guó)臨床及嬰幼兒配方奶粉中的菌株也形成了一個(gè)獨(dú)立分枝。其余的5株菌則形成了五個(gè)不同的分枝。這些結(jié)果對(duì)于具有相同序列型但來(lái)源不同的菌株溯源分析及克隆關(guān)系的驗(yàn)證將會(huì)有較大幫助。

        2.5 C.malonaticus ST 7菌株的cogMLST分析

        圖3 C.sakazakii ST13菌株的cogMLST分析

        如圖4所示,35株丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌ST7菌株的cogMLST聚類分析結(jié)果顯示,最早在1973年分離自美國(guó)臨床的菌株(編號(hào)71)與1988年分離自新西蘭的菌株(編號(hào)1485)及2005年分離自韓國(guó)的菌株(編號(hào)145)基因序列差異較小。兩株于2010年分離自中國(guó)水環(huán)境中的菌株(編號(hào)1489和1491)聚集到了一起。此外,兩株來(lái)源于美國(guó)昆蟲當(dāng)中分離時(shí)間為2012年的菌株(編號(hào)1842和1843)與另外兩株源自斯洛文尼亞臨床當(dāng)中分離時(shí)間為2017年的菌株(編號(hào)2567和2568)分別形成了2個(gè)獨(dú)立分枝。1977年分離自美國(guó)臨床的兩株菌(編號(hào)590和1556)也相對(duì)于其它菌株形成了一個(gè)單獨(dú)的分枝。在2007年至2013年分離自捷克共和國(guó)(編號(hào)399和619)和斯洛伐克(編號(hào)415)臨床的菌株聚集到了一起,另外7株分離自捷克共和國(guó)臨床的菌株則形成了兩個(gè)小的分枝。這些結(jié)果表明,丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌ST 7菌株的cogMLST聚類與菌株來(lái)源之間存在密切相關(guān)性,這對(duì)于該序列型致病菌的流行病學(xué)調(diào)查研究將會(huì)有較大幫助。

        圖4 C.malonaticus ST7菌株的cogMLST分析

        3 討論

        至今,分類學(xué)依舊是關(guān)于克羅諾桿菌研究的主題,因?yàn)闇?zhǔn)確的細(xì)菌分類對(duì)于可靠的監(jiān)管控制及溯源分析至關(guān)重要,而準(zhǔn)確的細(xì)菌分類則依賴于有效的分型方法[3,9,14]。同時(shí),無(wú)論是克羅諾桿菌的流行病學(xué)研究還是分子溯源方法的建立都必須基于對(duì)目標(biāo)生物多樣性的透徹理解。

        對(duì)于克羅諾桿菌屬各菌株之間的研究,7-loci MLST已被證實(shí)是一個(gè)非常有用的工具。最初Baldw in等[15]利用7-loci MLST成功地將C.sakazakii和C.malonaticus兩個(gè)種區(qū)分開(kāi)來(lái),同時(shí)結(jié)果顯示C.sakazakii ST 4菌株為優(yōu)勢(shì)菌株(22/60)。2012年Joseph等[16]采用7-loci MLST方法對(duì)325株克羅諾桿菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步證實(shí)了7個(gè)種的存在。此外,還發(fā)現(xiàn)C.sakazakii是臨床來(lái)源的優(yōu)勢(shì)菌種,C.sakazakii ST 4是腦膜炎病例腦脊液分離株的主要序列類型。2014年Forsythe等[9]進(jìn)一步對(duì)C ronobacter PubM LST數(shù)據(jù)庫(kù)中的1 007株克羅諾桿菌進(jìn)行了7-loci MLST分析和統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明,C.sakazakii克隆復(fù)合物(clonal complexes,CC)4菌株與臨床來(lái)源密切相關(guān),CC 1、CC 4和CC 7為主要序列型。2017年O grodzki等[17]繼續(xù)采用該方法對(duì)1 654株克羅諾桿菌進(jìn)行了分型和來(lái)源分析。結(jié)果顯示,大多數(shù)臨床菌株為C.sakazakii CC 1和CC 4,ST 8和ST 12以及C.malonaticus ST 7型。此外,F(xiàn)ei等[18-20]也在近幾年持續(xù)利用這一方法對(duì)分離自中國(guó)市售奶粉及乳品廠的克羅諾桿菌污染情況進(jìn)行了系統(tǒng)的調(diào)查分析,不僅揭示了多個(gè)主要序列型,而且證明了克羅諾桿菌在中國(guó)市售奶粉當(dāng)中的污染依舊明顯。

        由于7-loci MLST方法在克諾羅桿菌分型中的有效性,本研究使用7-loci MLST方法對(duì)C ronobacter PubM LST數(shù)據(jù)庫(kù)中已登記的2 438株菌進(jìn)行了序列定義及統(tǒng)計(jì)分析。7-loci MLST共揭示了591種ST,其中ST1(280株)、ST4(334株)、ST 7(78株)和ST 13(67株)為主要序列型。多數(shù)菌株來(lái)源于食品及配料當(dāng)中,并于1950至2017年分離自40多個(gè)國(guó)家。由于MLST所針對(duì)的七個(gè)基因位點(diǎn)在基因組總量中占比較小,導(dǎo)致同一ST型中包含地理來(lái)源,分離時(shí)間,宿主等不相關(guān)的菌株,而對(duì)菌株溯源結(jié)果適得其反。

        全基因組測(cè)序由于獲得的序列信息量足夠大,是當(dāng)前研究克羅諾桿菌分型最有效的方法,并可以對(duì)該致病菌進(jìn)行精確的溯源[21-26]。關(guān)于克羅諾桿菌相同ST菌株的溯源分析之前已有研究[13,17,27-28],M asood等[28]采用基于全基因組序列的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide po lym orphism,SNP)分型技術(shù)對(duì)1994年法國(guó)N ICU的C.sakazakii相同ST菌株進(jìn)行了溯源分析,其結(jié)果顯示SNP分型方法可以對(duì)相同序列型菌株進(jìn)一步分型,來(lái)自不同基因型簇的阪崎腸桿菌分離株都具有感染新生兒的能力,然而爆發(fā)來(lái)源尚未確定。此外,Guo等[13]也通過(guò)利用SNP分析對(duì)源自乳品的32株C.sakazakii ST 13菌株進(jìn)行了分型研究,結(jié)果表明,SNP聚簇與原產(chǎn)地及乳制品產(chǎn)品類型之間未呈現(xiàn)有明顯的相關(guān)性。雖然SNP分析方法具有高度歧視性,但對(duì)參考菌株選取較為敏感,即選取不同參考菌株,SNP分型結(jié)果存在差異較大[29]。同時(shí)SNP分析是計(jì)算密集型的,因此分析流程較長(zhǎng);對(duì)于分析大型序列集,必須用高性能計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析。此外,應(yīng)用該方法進(jìn)行分析需要大量的生物信息學(xué)知識(shí)?;赪GS的擴(kuò)展的多位點(diǎn)序列分型方法[30]相較于SNP分析則具備諸多優(yōu)勢(shì),如其具有穩(wěn)定的菌株命名法和完善的數(shù)據(jù)庫(kù),能夠?qū)崿F(xiàn)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化和可擴(kuò)展性,分析速度快、計(jì)算要求復(fù)雜度低且無(wú)需生物信息專業(yè)知識(shí)。因而本實(shí)驗(yàn)并未采用SNP分型技術(shù)繼續(xù)對(duì)相同ST菌株進(jìn)行溯源分析,而是選用了基于全基因組測(cè)序的擴(kuò)展的MLST方法對(duì)C ronobacter PubM LST數(shù)據(jù)庫(kù)中240株已完成全基因組測(cè)序的菌株進(jìn)行了分型研究。

        本研究中所采用的基于全基因組測(cè)序的擴(kuò)展的MLST方法最初是由Forsythe等[9]人建立的cogMLST分析方案,2014年他們利用這一方法對(duì)107株克羅諾桿菌進(jìn)行了全基因組序列分析,進(jìn)一步證實(shí)了C.sakazakii CC 4克隆譜系的穩(wěn)健性。然而,尚未有報(bào)道將該方法應(yīng)用于相同ST菌株的溯源研究當(dāng)中。本實(shí)驗(yàn)首次利用cog MLST方法對(duì)克羅諾桿菌的主要序列型菌株包括:阪崎克羅諾桿菌ST1(67株),ST 4(95株),ST 13(43株)和丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌ST 7(35株)分別進(jìn)行了全基因組序列分析。結(jié)果顯示,該方案可對(duì)相同ST內(nèi)的無(wú)關(guān)菌株進(jìn)一步細(xì)分,不同聚類與菌株分離國(guó)家及來(lái)源之間存在一定相關(guān)性。

        cogMLST分析方法在具有較高流行病學(xué)一致性的基礎(chǔ)上,能夠?qū)崿F(xiàn)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化,分析速度快,對(duì)計(jì)算要求復(fù)雜度低且無(wú)需專業(yè)的生物信息知識(shí)背景,從而能夠快速應(yīng)用于疾病爆發(fā)過(guò)程中克羅諾桿菌屬菌株的精準(zhǔn)溯源分析及高效監(jiān)管防控當(dāng)中。此外,通過(guò)采用cogMLST方法對(duì)克羅諾桿菌的主要序列型菌株的成功細(xì)分表明,過(guò)去基于單個(gè)或多個(gè)基因的分型方法由于納入分析的信息有限,的確誤將許多無(wú)關(guān)菌株劃分到了一起。同時(shí),通過(guò)結(jié)果當(dāng)中所揭示的不同聚類與菌株分離國(guó)家及來(lái)源之間的密切相關(guān)性,能夠進(jìn)一步表明cogMLST方法對(duì)于克羅諾桿菌的溯源分析將是極為有效的分型方法之一。最后,隨著越來(lái)越多克羅諾桿菌屬菌株全基因測(cè)序數(shù)據(jù)的公開(kāi),選取有效的全基因組序列分析方法對(duì)于相同ST菌株的全球溯源分析及食源性疾病監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。

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