孟新濤，魏 健，許銘強，李德華，譚 歸，朱麗娜，邵文志，潘 儼

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所， 烏魯木齊 830091；2.新疆主要農(nóng)副產(chǎn)品精深加工工程技術研究中心，烏魯木齊 830091 3.喀什大學生命與地理科學學院，新疆喀什 844006；4.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】石榴(PunicagranatumL.)屬石榴科(Punicaceae)石榴屬(PunicaL.)植物，是一種集生態(tài)、經(jīng)濟、社會效益、觀賞價值與保健功能于一身的優(yōu)良果樹，具有極高的營養(yǎng)價值[1-2]及醫(yī)用保健功能[3]。新疆石榴主要分布在喀什、和田、阿克蘇及克孜勒蘇州等地區(qū)，主要品種有皮亞曼、千籽紅、賽檸檬和葉城石榴等[4-5]，占石榴果實總重量的11%～21%的石榴皮，在生產(chǎn)中食用與加工時被丟棄，造成嚴重的浪費[2]。目前，我區(qū)石榴深加工企業(yè)較少，分析不同品種石榴果皮中類黃酮物質(zhì)的組分及含量，對新疆石榴類黃酮物質(zhì)的良種選育和綜合開發(fā)利用有實際意義?！厩叭搜芯窟M展】類黃酮是黃酮類化合物的簡稱，是一類三元環(huán)色素的總稱[6-7]，是人類膳食攝入不可缺少的組成部分[8-10]，對人體有多種生理功能且不良反應少，是一類安全可靠、成本低、來源廣的營養(yǎng)物質(zhì)，有較大的開發(fā)和應用前景[11，12]。研究表明，石榴中富含類黃酮物質(zhì)，其果實提取物對心腦血管疾病、細菌感染等具有顯著的防治作用[13-14]。測定分析方法主要包括分光光度法、毛細管電泳法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[15-18]。高效液相色譜法(HPLC)作為一種簡單、高效、快速的檢測方法已被廣泛應用[15-18]。目前，黃酮類成分的含量測定方法多以蘆丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚、異鼠李素為測定對象，但用槲皮素、山奈酚、異鼠李素中其中一種的量換算成總黃酮的量并不能準確反應提取物總黃酮的含量；因此建立石榴皮提取物中5種黃酮類成分(蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素)的同時測定方法具有重要意義[18]?！颈狙芯壳腥朦c】國內(nèi)外學者關于石榴中的類黃酮研究開展較早，但研究主要集中在石榴汁、石榴花、石榴葉等類黃酮物質(zhì)的定性分析和總量測定等方面，且大多局限于某一單一品種研究。研究新疆石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)的測定方法。【擬解決的關鍵問題】以4個不同石榴品種為試材，采用高效液相色譜法(HPLC)提取和測定，石榴果皮中蘆丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚和異鼠李素)的含量比較分析4個不同品種石榴果皮中類黃酮物質(zhì)的組分及含量差異，為新疆石榴類黃酮物質(zhì)的開發(fā)利用和良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

千籽紅石榴采集于新疆喀什市；皮亞曼石榴、賽檸檬石榴采集于新疆和田市皮山縣；葉城石榴采集于喀什市葉城縣；采集時間均為2015年10月；蘆丁、槲皮素、槲皮苷、山奈酚、異鼠李素(純度≥98%)所有標準品為HPLC級，北京世紀奧科生物技術有限公司；D101大孔吸附樹脂，安徽省蚌埠市遼源新材料有限公司；甲醇(色譜純)，天津市致遠化學試劑有限公司；甲酸(色譜純)，天津市致遠化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純；氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCL)，四川西隴化工有限公司。

Anglient HPLC 1260高效液相色譜儀，配有可變波長紫外檢測器、示差折光檢測器和EZChrom Elite工作站美國安捷倫公司；RE100-Pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 美國Scilogex公司；DZG-303A“艾柯”實驗室專用超純水儀 成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；eppendorf 5810R冷凍型臺式大容量高速離心機 德國eppendorf；pHS-3C型酸度計 上海雷磁儀器廠；SK7200H型超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 標準溶液的配制及標準曲線的繪制

(1)標準溶液配置

準確秤取蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素各5 mg；分別加入甲醇溶液溶解后定容到10 mL容量瓶，得到濃度分別為0.5 mg/mL的標準溶液。檢測限與定量限按照《中華人民共和國藥典》確定5種對照品的檢測限與定量限[22]。

(2)標準曲線繪制

準確吸取標準溶液，配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，其中蘆丁標準溶液的濃度梯度為0.001、0.002、0.002 5、0.006、0.015 和0.02 mg/mL，槲皮苷標準溶液的濃度梯度為0.001、0.002、0.003、0.004、0.008、0.012和0.016 mg/mL，槲皮素標準溶液的濃度梯度為0.001 、0.005、0.01、0.015、0.02和0.025 mg/mL，山奈酚標準溶液的濃度梯度為0.001、0.002、0.003 、0.004、0.008、0.012和0.016 mg/mL，異鼠李素標準溶液的濃度梯度為0.001、0.002、0.003 、0.004 、0.008、0.012和0.016 mg/mL，每次吸樣量為20 μL，經(jīng)過高效液相色譜檢測。以峰面積為橫坐標，質(zhì)量濃度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 樣品前處理

石榴皮粉末的制備[3]：將石榴樣品洗凈后取皮，剔除褐變及腐爛部分果皮，置于40 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干，用研磨機粉碎，過100目篩，置于干燥器中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

黃酮類化合物的提取[3]：稱取石榴皮粉末1.00 g，置于250 mL錐形瓶中，加入24 mL87%乙醇，59 ℃超聲26 min，抽濾，再用24 mL95%乙醇溶解濾渣，超聲26 min，合并濾液。30 ℃減壓回收溶劑至近干，加10 mL 30%乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，棄去醚層，收集樣品用30%乙醇定容至50 mL容量瓶中。吸取1 mL于25 mL容量瓶中，30%乙醇定容至刻度，搖勻備用。

樹脂的預處理[1]：將D101大孔樹脂中的破碎樹脂剔除，用蒸餾水浸泡洗去雜物，乙醇浸泡48 h使其溶脹，再用蒸餾水洗至無醇味。在內(nèi)徑10 mm，高300 mm的玻璃層析柱中濕法裝柱后，用4% HCl溶液以3～5 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2 h，而后用去離子水以同樣流速洗至出水pH為中性；再用4% NaOH溶液，以3～5 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2 h，而后用去離子水以同樣流速洗至出水pH中性。備用。

1.2.3 樣品溶液純化

利用D101大孔吸附樹脂，在溫度30 ℃、吸附料液比1:4(g/mL)、pH為4、洗脫液體積為90%的條件下純化，用蒸餾水洗脫除雜后，用30 mL乙醇洗脫出黃酮類化合物，收集洗脫液定容至50 mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 HPLC色譜條件

色譜柱：C18柱(Agilent Poroshell 120 EC-C18柱，250 mm× 4.6 mm，孔徑4 μm；)；流動相：100%甲醇: 0.2%甲酸=55: 45，流動相經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，并經(jīng)超聲波脫氣；流速：0.5 mL/min，進樣量20 μL，柱溫40 ℃，；檢測波長：360 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種類黃酮標準品色譜圖

研究表明,5種類黃酮標準品流出順序分別為蘆丁(保留時間為6.95 min)，槲皮苷(保留時間為8.25 min)，槲皮素(保留時間為12.12 min)，山奈酚(保留時間為18.20 min)，異鼠李素(保留時間為21.1 min)。圖1

圖1 對照品中5種類黃酮色譜圖

Fig.1 HPLC chromatograms of 5flavonoids in standard products

2.2 線性范圍、檢出限、定量限

研究表明,蘆丁、槲皮苷、槲皮素、異鼠李素、山奈酚對照品的檢測濃度在對應的線性范圍內(nèi)與峰面積積峰值成良好的線性關系。

蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素定量限(信噪比10∶1)分別為 0.325、0.504、0.364、0.552及 0.447 μg/mL，檢測限(信噪比 3∶1)分別為0.134、0.152、0.165、0.226及0.207 μg/mL。表1

表1 5種類黃酮的線性關系Table.1 Linearity determination of the flavonoids

組分Component回歸方程RegressionequationR2線性范圍(μg/mL)蘆丁RutinY=2.83870×10-9X-0.0001516430.99191^20槲皮苷QuercitrinY=3.313960×10-9X-0.0001416780.99911^16槲皮素QuercetinY=2.127470×10-9X+0.0003521180.99911^30山奈酚ShanafelY=1.310520×10-9X+0.0002207290.99941^16異鼠李素HeterodermLisuY=2.404460×10-9X+0.0001217310.99971^16

注:回歸方程中X代表峰面積,Y代表質(zhì)量濃度。

2.3 回收率

準確稱取5種類黃酮含量已知的皮亞曼石榴皮粉末、賽檸檬石榴皮粉末、千籽紅石榴皮粉末和葉城石榴皮粉末各6份，分別向其中定量添加混合標準溶液，并按照1.2.2的方法制備供試品溶液，按1.2.4的色譜條件進樣20 μL，根據(jù)測定結(jié)果中5種單體黃酮的含量計算相應的回收率。表2

表 2 加標回收率測定結(jié)果(n = 6)

Table 2 experiment results of recovery (n = 6)

化合物Compound樣品量SampleQuantity(mg/100g)添加量Addition(mg/100g)測得量Measuredamount(mg/100g)平均回收率Averagerecoveryrate(%)皮亞曼石榴皮PiyamanPomegranateskin蘆丁14.737.54888.8槲皮苷160.2294532.5126.6槲皮素2.32023103.5山奈酚1.3201778.5異鼠李素0.52018.591.13賽檸檬石榴皮SainingmengPomegranateskin蘆丁13.237.547.591.4槲皮苷129.5294439105.2槲皮素1.92023.5108山奈酚12026124.47異鼠李素02022108.27千籽紅石榴皮QianzihongPomegranateskin蘆丁7.537.541.590.6槲皮苷127.7294468115.7槲皮素1.52022.5105.98山奈酚1201884.41異鼠李素02021.5105.87葉城石榴皮YechenPomegranateskin蘆丁14.837.54888.5槲皮苷79.5294408111.7槲皮素3.52024.5103.60山奈酚2.5201982.80異鼠李素22021.597.40

2.4 精密度

在對方法進行驗證的過程中，分別對皮亞曼、千籽紅、賽檸檬和葉城石榴4個石榴品種類黃酮提取物進行了測試，按照1.4.1色譜條件進樣20 μL，重復進樣6次，計算不同進樣次數(shù)對應的峰面積，得不同品種石榴皮類黃酮提取物對應的RSD平均值。蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素分別對應的RSD為1.25%，1.19%，1.80%，0.82%，0.19%。該方法精密度良好，可以滿足石榴皮類黃酮檢測要求。

2.5 重復性實驗

準確稱取皮亞曼、千籽紅、賽檸檬和葉城石榴石榴皮各1.000 g，平行制備6份樣品溶液，按照HPLC色譜條件，進樣20 μL，按照HPLC色譜條件，進樣20 μL，計算每一份蘆丁對應的峰面積，得平均RSD均小于2%，該方法重復性良好。表3

表3 重復性(n=6)

Table 3 Reproducibility test (n=6)

實驗號Nomber葉城酸石榴蘆丁含量RutincontentofYechen(mg/100g)皮亞曼石榴蘆丁含量RutincontentofPiyaman(mg/100g)賽檸檬石榴蘆丁含量RutincontentofSainingmeng(mg/100g)千籽紅石榴蘆丁含量RutincontentofQianzihong(mg/100g)10.226670.32196440.27109580.19166320.22674980.32740670.26348150.194831330.22245350.32757350.2679950.192947340.23070050.33263540.27653630.191272750.22550120.32429540.27373130.190705460.22587020.32567630.27461720.1927679平均值0.22632420.3265920.27124290.1923646SD2.42619E-053.30851E-054.40469E-051.3555E-05RSD0.010719990.0101304010.0162389290.007046499

2.6 穩(wěn)定性實驗

準確稱取皮亞曼石榴皮樣品，按照樣品溶液制備方法制備進樣溶液，在2.1.5色譜條件下，分別于1、3、5、7、9、11h進樣，測定樣品溶液中的5種類黃酮物質(zhì)中槲皮苷的含量，計算RSD值均小于2%。表明供試品溶液在11 h內(nèi)穩(wěn)定，該方法穩(wěn)定性良好。

2.7 不同品種石榴皮中5種類黃酮物質(zhì)測

研究表明,4個石榴品種果皮中均檢測到蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素這5種類黃酮組分，且槲皮苷和蘆丁是石榴皮5種類黃酮中的主體成分：葉城石榴皮中蘆丁、槲皮苷分別占13.8%和76.7%，合計90.5%。皮亞曼石榴皮中蘆丁、槲皮苷分別占8.1%和89.2%，合計97.3%。賽檸檬石榴皮中蘆丁、槲皮苷分別占9.08%和88%，合計97.08%。千籽紅石榴皮中蘆丁、槲皮苷分別占5.5%和91.6%，合計97.1%。槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量較低。圖2

圖2 石榴皮提取物中5種類黃酮色譜圖

Fig.2 HPLC chromatograms of 5flavonoids in pomegranate leather extracts

皮亞曼石榴皮中槲皮苷含量是葉城石榴皮的1.84倍，賽檸檬和千籽紅石榴皮中槲皮苷含量低于皮亞曼，且高于葉城石榴皮1.5倍，4個品種中千籽紅石榴皮蘆丁含量低于其他品種。不同品種石榴皮提取物中蘆丁、槲皮苷、槲皮素、異鼠李素、山奈酚總含量由高到低為：皮亞曼石榴皮>賽檸檬石榴皮>千籽紅石榴皮>葉城石榴皮。表4

表4 不同品種石榴果皮中5種類黃酮物質(zhì)含量(n=3)

Table 4 Contents of five flavonoids in peels of pomegranate (n=3) (mg/100 g)

類黃酮物質(zhì)Flavonoids蘆丁Rutin槲皮苷Quercitrin槲皮素Quercetin山奈酚Shanafel異鼠李素HeterodermLisu總和Sum葉城Yecheng15.8±0.587.8±0.84.6±0.43.3±0.12.9±0.6114.5±0.6皮亞曼Piyaman14.7±0.7162.2±0.32.6±0.21.3±0.20.7±0.4181.7±0.3賽檸檬Sainingmeng13.6±0.2131.7±0.82.4±0.51.2±0.60.6±0.8149.7±0.2千籽紅Qianzihong7.9±0.6131.7±0.82.2±0.11.1±0.70.6±0.5143.8±0.4

3 討 論

類黃酮物質(zhì)是石榴中重要功能性物質(zhì)之一，是評價石榴果實品質(zhì)的重要指標[23-24]。de Pascual-Teresa[10]等從石榴果皮中檢測出4種黃烷醇。朱峰[8]等從泰山紅、大青皮、墨石榴和三白4個石榴品種果皮中檢測到楊梅酮、槲皮素、木犀草素、山奈素、芹菜素5種類黃酮物質(zhì)。試驗采用HPLC在4個石榴品種中檢測到5種類黃酮組分物質(zhì)，分別為蘆丁、槲皮苷、槲皮素、異鼠李素和山奈酚，5種類黃酮含量最高的品種為皮亞曼石榴，總含量為181.7 mg/100 g,其次為賽檸檬石榴，含量為149.7 mg/100 g，千籽紅石榴類黃酮含量為143.8 mg/100 g，葉城石榴類黃酮含量較低，為114.5 mg/100 g。研究與上述報道有差別，原因可能與不同品種有關，此外可能還與生長環(huán)境、貯存條件、成熟程度等多種因素有關。

研究顯示不同石榴品種類黃酮組分和含量有一定差異性，在皮亞曼石榴果皮中，其類黃酮含量整體較高，是石榴功能食品育種的優(yōu)異資源。另外，在目前的石榴加工產(chǎn)業(yè)中，石榴皮大多數(shù)都被廢棄扔掉，研究顯示石榴皮具有較高的開發(fā)利用價值。

4 結(jié) 論

建立的高效液相色譜分析方法在21 min內(nèi)完成蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素5種類黃酮的分離，分離度較好。5種類黃酮化合物的標準曲線線性線性關系良好，其精密度實驗結(jié)果相對標準偏差均<2%，回收率在76.68%～124.50%范圍類，檢出限為0.2 mg/kg，定量限為5 mg/kg，是一種檢測分析石榴類黃酮組成和含量的簡便、快速和準確的方法。