祝鑒知

（安徽省馬鞍山市人民醫(yī)院 安徽 馬鞍山 243000）

為了制備術中快速診斷組織學切片，需要采用冷凍方法促使生物樣本硬化，而冷凍卻會損傷細胞膜，破壞生物樣本組織細胞形態(tài)(見圖1)。鑒于此，我們要做的是分析冷凍損傷的成因和后果，以使這種損傷最小化，盡可能地規(guī)避這種損傷。

1.資料與方法

1.1 一般資料

恒溫冷凍制片機型號：Thermo A7890103，設定工作室溫度：-20℃，設定冷凍臺溫度-40℃。實驗分析所用樣本均來自于本院病理科術中快速，80例樣本均采用乳腺上皮惡性腫瘤標本[1]。

1.2 方法

為了揭示出樣本凍結速度與冰凍損壞率之間的關系，進而標識出臨床適用的、可撐控的凍結速度，本文依照不同的冰凍條件，即通過不同的操作程式來實現(xiàn)。將80例標本分成4組，每組20例。取材規(guī)格統(tǒng)一為2×1×0.2cm，制片完成后鏡下觀察。取材規(guī)格依照病理取材技術操作規(guī)范[2-3]。

第1組：20例樣本，取樣后，均直接放置在未開啟的冷凍臺上，即在工作室溫度-20℃條件下完成凍結。

第2組：20例樣本，在工作室溫度-20℃條件下，先將樣本放置在冷凍臺上，而后再開啟冷凍臺，冷凍臺在開啟后溫度逐漸降至-40℃，并完成凍結。

圖1 受損傷與未受損傷切片的對比

第3組：20例樣本，是首先開啟冷凍臺，再取材，約5分鐘左右，這時冷凍臺溫度已達-40℃，再將樣本放置冷凍臺冷凍，并完成凍結。

第4組：20例樣本，首先開啟冷凍臺(同第3組)，再開啟“冷凍加速”，取材約5分鐘后，冷凍臺溫度達-40℃，再將樣本放置冷凍臺，并完成凍結。

2.結果

實驗結果列于表1，其表明，第1組樣本凍結完成時間在2’21”至2’39”之間，平均為2’28”，20例標本組織細胞全部出現(xiàn)損傷現(xiàn)象，損傷率為100%。第兩組樣本凍結完成時間在1‘25“至1’45”之間，平均為1‘33”，其中有6例都出現(xiàn)了多孔及組織形態(tài)攺變，損傷率為30%。第3組樣本凍結完成時間在1’15”～1‘30”之間，平均為1’21”，有1例受損，損傷率為5%。第4組樣本凍結完成時間在1‘02“～46”之間，平均為53”。鏡下觀察20例組織切片，無1例損壞。

可以看出，即使是同種病組織、組織取材尺寸亦相同的同一組20例樣本，在同一冷凍臺上，以相同的冷凍條件下測試，它們的凍結速度也不是相同的，足可見樣本個體差異性的影響。

表 實驗結果一覽表

圖2表示出冰凍切片損傷率隨冷凍速度(以平均表示)的變化，在冷凍速度53”～2’28”區(qū)間(1’35”)，冰凍損傷率近乎呈直線從0%急劇上升到100%，損傷率對冷凍速度的敏感可見一斑。而在冷凍速度53”以下區(qū)間，即在第4組冷凍條件下，冰凍損傷率穩(wěn)定地保持0損傷，因此適合于術中冰凍制片使用。

圖2 損傷率隨凍結時間的變化

3.討論

生物材料的導熱性能差，凍結時會出現(xiàn)溫度梯度，使樣本在緩慢冰凍時逐漸形成大量晶體，特別是在遠離凍結表面的部分，切片后大的晶體在組織切片上呈現(xiàn)出“瑞士奶酪”的形態(tài)。所以取材尺寸不應過厚過大，取材規(guī)格應依照病理取材技術操作規(guī)范[6]，面積大小一般為2×1厘米，厚度為0.2～0.4厘米。如果組織取材過厚，會由于生物材料導熱性差而導致組織內(nèi)局部凍結速度慢而產(chǎn)生冰晶，損傷組織，影響診斷。

然而在樣本被成功冷凍成玻璃體后并不能一直保持玻璃形態(tài)。固體水的玻璃體形態(tài)是不穩(wěn)定的，當溫度高于-121℃時無定形水即開始逐漸重組為立方冰并膨脹，但重要的是這是一個緩慢的轉換過程，這使得冰凍快速制片有足夠的時間能夠完成。

通過探索，逐步加快組織冰凍速度，縮短組織冰凍時間，有效地減少甚至消除了冰凍制片中出現(xiàn)的“瑞士奶酪”現(xiàn)象。使術中冰凍快速制片中的組織損害得到非常大的改善，提高了病理診斷準確性。