米凱 黃銳（通訊作者）

（1 核工業(yè)四一六醫(yī)院＜成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院＞普外科 四川 成都 610501）

（2 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 四川 成都 610072）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種致死率較高的惡性腫瘤，發(fā)病率一直居高不下，嚴(yán)重危害人類的生活健康。僅有少數(shù)肝癌患者被明確診斷時具有手術(shù)的機會，且術(shù)后存活期短，多數(shù)肝癌患者通常預(yù)后較差，并伴有高轉(zhuǎn)移風(fēng)險、易復(fù)發(fā)等[1]。目前，尋找新的治療靶標(biāo)及有效治療手段迫在眉睫，且在分子水平了解肝癌發(fā)病機制，對發(fā)現(xiàn)潛在的診斷和治療靶點，從而對肝癌的早期診斷和治療提供實驗基礎(chǔ)具有重要意義。配子體特異性因子1（GTSF1）基因參與生殖細(xì)胞中的DNA甲基化和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子活化，特別是在細(xì)胞增殖期間[2]。本文旨在評估肝癌組織中GTSF1基因表達的水平，以及其在人肝癌細(xì)胞系中的作用，為肝癌發(fā)生的分子病因及肝癌診斷和治療提供方向。

1.資料與方法

1.1 對象

選擇2016年1月－2018年12月四川省醫(yī)院4例術(shù)后肝癌組織標(biāo)本及其癌旁組織（距離肝癌組織5cm以上）標(biāo)本。均簽署知情同意書，經(jīng)四川省醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實時熒光定量PCR檢測

采用RNA提取試劑盒（Invitrogen）提取結(jié)肝癌組織、癌旁組織總RNA，測定A260和A280吸光度值，電泳確定RNA的完整性后，依據(jù)mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，合成cDNA，用PCR儀擴增，實驗結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中進行分析對比，采用2-ΔΔCt對GTSF1 mRNA表達進行相對定量。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HepG2肝癌細(xì)胞（南京凱基生物）在含10%胎牛血清、含1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于溫度37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，根據(jù)所轉(zhuǎn)染的siRNA的不同分成對照組、NC-siRNA組和GTSF1 siRNA組，分別轉(zhuǎn)染GTSF1的siRNA，NC的siRNA，37℃孵育48h后收集所有細(xì)胞。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

取收集的細(xì)胞，按照CCK-8檢測試劑盒（北京索萊寶生物）說明檢測，將各實驗組細(xì)胞按每孔3×103個細(xì)胞接種于96孔板，加入100μL完全培養(yǎng)液于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48h后，每孔加入10μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4h后用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在450nm處的吸光度值（A），細(xì)胞增殖活力（%）=（A實驗組-A對照組）/A對照組×100%。

1.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取收集的細(xì)胞，按Annexin V-PI說明書（北京索萊寶生物）檢測，各實驗組細(xì)胞以5×105/mL的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)48h后取出6孔板，用PBS清洗細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)液，常規(guī)重懸后加入AnnexinV APC、7-AAD，輕輕搖動，使其混合均勻，室溫避光孵育15min，上流式細(xì)胞儀（美國BD）檢測，總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 GTSF1表達水平

RT-PCR結(jié)果顯示，癌旁組織中GTSF1 mRNA表達顯著低于肝癌組織（P＜0.05），見圖1。

圖1 GTSF1 mRNA表達

2.2 細(xì)胞增殖、凋亡比較

細(xì)胞增殖結(jié)果顯示GTSF1 siRNA組細(xì)胞增殖顯著低于NC-siRNA組及對照組（P＜0.05），細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示GTSF1 siRNA組細(xì)胞凋亡顯著高于NC-siRNA組及對照組（P＜0.05），見表、圖2。

表 不同處理組細(xì)胞增殖、凋亡比較

圖2 細(xì)胞凋亡

3.討論

肝癌（HCC）與肺癌、胰腺癌一起被稱為病死率最高的三大癌癥。我國是肝癌高發(fā)大國，世界上將近一半的新發(fā)肝癌患者在中國，且發(fā)病率近年居高不下，而HCC的發(fā)生是一個復(fù)雜多步驟過程，涉及調(diào)節(jié)基因中遺傳和表觀遺傳改變的積累。癌癥相關(guān)分子的鑒定可能導(dǎo)致治療的新分子靶標(biāo)和預(yù)測預(yù)后的生物標(biāo)志物的發(fā)展。因此，多種遺傳和表觀遺傳因素可能影響HCC的發(fā)展[3]。已有研究報道，GTSF1基因參與生殖細(xì)胞中的DNA甲基化和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子激活，特別是在細(xì)胞增殖中，并且它存在于MF腫瘤樣品中，表明它可能在MF的細(xì)胞凋亡抗性中發(fā)揮作用[4]。同時，GTSF1基因可以在各種生理過程中起到增殖因子的作用[5]。就肝癌而言，已有許多關(guān)于與肝癌發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志物的研究，并且已經(jīng)通過腫瘤組織的基因表達譜確定了具有診斷和預(yù)后潛力的基因標(biāo)記[6]。本結(jié)果中，確定肝癌組織樣品中GTSF1 mRNA表達較其在相鄰的非腫瘤肝組織中表達明顯增加（P＜0.05），提示GTSF1可能參與肝癌發(fā)生，其表達水平可能是肝癌診斷的潛在生物標(biāo)志物。

在腫瘤發(fā)展期間，腫瘤標(biāo)志物的數(shù)量、類型、分布和表達水平與腫瘤密切相關(guān)，然而，尚缺乏理想的腫瘤標(biāo)志物用于肝癌的診斷和預(yù)后的評價[7]。研究表明GTSF1在肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系中經(jīng)常上調(diào)，且GTSF1可在體外增加集落形成，證明GTSF1促進體內(nèi)腫瘤生長。所有這些數(shù)據(jù)都強調(diào)了GTSF1在腫瘤發(fā)生中的基本作用，特別是在肝癌的發(fā)展中。因此，GTSF1表達可能在體內(nèi)HCC腫瘤細(xì)胞的增殖中起關(guān)鍵作用[2]。為了探索GTSF1的作用，采用siRNA轉(zhuǎn)染腫瘤HepG2細(xì)胞，觀察GTSF1基因?qū)?xì)胞增殖及凋亡的影響，結(jié)果顯示GTSF1 siRNA組細(xì)胞增殖顯著低于NC-siRNA組及對照組（P＜0.01），GTSF1 siRNA組細(xì)胞凋亡顯著高于NC-siRNA組及對照組（P＜0.05）。表明GTSF1的過表達參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖、增加致癌性。

綜上所述，GTSF1基因在肝癌發(fā)生的分子病因?qū)W中具有重要作用，提示GTSF1 mRNA表達在肝癌診斷和治療中的潛在應(yīng)用。由于所涉及的病例數(shù)量相關(guān)的限制，并且患者均來自本研究中的單個區(qū)域，GTSF1 mRNA和蛋白質(zhì)表達在肝癌中的功能還需進一步觀察。