韓麗芳 王珍 關(guān)穎

（1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)祈福醫(yī)院病理科 廣東 廣州 511495）

（2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)祈福醫(yī)院科教科 廣東 廣州 511495）

（3 南方醫(yī)科大學(xué)生物統(tǒng)計學(xué)系 廣東 廣州 511495）

結(jié)直腸癌（CRC）作為最常見的惡性腫瘤之一，在全世界男性的發(fā)病率排名第3位，病死率第4位，女性的發(fā)病率排名第2位，病死率第3位。晚期結(jié)直腸癌(指局部晚期或遠處轉(zhuǎn)移），占所有結(jié)直腸癌的50%。我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率呈明顯上升趨勢，且發(fā)病年齡有所提前。而針對結(jié)直腸癌的治療，仍然是以手術(shù)為主、放化療等為輔的綜合治療方法，以減少腫瘤細胞數(shù)量來達到治療效果。但是，術(shù)后5年生存率低、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率及耐藥率高。目前，腫瘤免疫治療是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點，是一種療效顯著的腫瘤治療模式。腫瘤免疫治療是通過調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，增強抗腫瘤免疫力，從而抑制和殺傷腫瘤細胞。PD-1是一種重要的免疫抑制分子，近期研究發(fā)現(xiàn)PD-1和PD-L1的抑制劑在多種腫瘤類型中療效顯著。本研究將收集既往結(jié)直腸癌病例，運用免疫組化方法檢測癌組織、癌旁組織及其浸潤淋巴細胞中PD-1/PD-L1的蛋白表達，分析其與臨床參數(shù)，如性別、年齡、腫瘤大小、組織類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的相關(guān)性，探討PD-1/PD-L1的蛋白表達在結(jié)直腸癌早期診斷、免疫靶向治療、預(yù)后評估中的應(yīng)用價值。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集廣東祈福醫(yī)院2012年1月－2018年10月期間結(jié)直腸癌標本172例作為病例組，隨機選取其中50例距腫瘤組織＞5 cm的癌旁組織及50例非腫瘤體檢者正常腸粘膜作為對照組。病例組術(shù)前均未行放化療，臨床資料完整，其中男104例，女68例；年齡31～94 歲，平均年齡64 歲；腫瘤直徑（癌結(jié)節(jié)）1.5～10cm，中位大小4.5cm；依據(jù)分化程度，低分化8例，中分化150例，高分化14例；按照AJC C（2010 ）第七版結(jié)直腸癌 TNM 分期標準[1]，Ⅰ～Ⅱ期88例，Ⅲ～Ⅳ期84例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者82例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者90例；有脈管癌栓者90例，無脈管癌栓者82例。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)法檢測PD-1、PD-L1的表達及分布 采用EnVision兩步法，一抗室溫孵育2h，二抗室溫孵育30min，經(jīng)DAB顯色蘇木精復(fù)染。鼠抗人PD-1（NAT）單克隆抗體即用型，兔抗人PD-L1（MXR003）單克隆抗體即用型，均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 結(jié)果判定

免疫組化結(jié)果由2名中級以上病理醫(yī)師雙盲獨立觀察評估。PD-Ll和PD-l以細胞質(zhì)或細胞膜出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒為陽性顯色。PD-Ll以陽性細胞數(shù)≥1%判為陽性，＜1%判為陰性[2]，分別評價腫瘤細胞及間質(zhì)細胞的表達情況。PD-l表達于腫瘤間質(zhì)浸潤的淋巴細胞，以陽性細胞數(shù)≥5%判為陽性，＜5%判為陰性[3]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 PD-1、PD-L1在結(jié)直腸癌組織及淋巴結(jié)中的表達

PD-1蛋白表達定位于結(jié)直腸癌間質(zhì)浸潤的淋巴細胞中，陽性部位為細胞膜及細胞質(zhì)，陽性率為32.6%（56/172）。PD-L1蛋白表達主要定位于癌細胞和癌間質(zhì)淋巴細胞的細胞質(zhì)和細胞膜，其總體陽性率為65.1%（112/172），其中癌細胞上表達陽性率為24.4%（42/172），癌間質(zhì)淋巴細胞上表達陽性率為65.1%（112/172）。50例癌旁組織間質(zhì)淋巴細胞可見少量PD-1和PD-L1表達，其中PD-1陽性率為6%（3/50），PDL-1陽性率為8%（4/50）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中PD-1和PDL-1表達率分別為23.2%（19/82）和61.0%（50/82），與其對應(yīng)的原發(fā)腫瘤組織表達高度一致；見圖1。

圖1 A：PD-L1癌細胞陽性；B：PD-L1癌間質(zhì)浸潤淋巴細胞陽性；C：PD-1癌間質(zhì)浸潤淋巴細胞陽性

2.2 結(jié)直腸癌組織中PD-1、PD-L1蛋白表達的相關(guān)性

χ2檢驗結(jié)果顯示，PD-1、PD-L1兩者的蛋白表達呈顯著正相關(guān)，癌細胞及癌間質(zhì)浸潤淋巴細胞中PD-L1的表達均與PD-1表達具有顯著差異(P＜0.001)，見表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中PD-L1表達水平與PD-1陽性淋巴細胞相關(guān)性（n）

2.3 結(jié)直腸癌中PD-1、PD-L1蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

癌細胞中PD-L1表達與年齡有關(guān)(P＜0.01)。癌間質(zhì)浸潤淋巴細胞中PD-L1表達與年齡、TNM分期以及浸潤深度(P＜0.05)有關(guān)。癌組織中PD-1表達與性別和腫瘤大小(P＜0.05)有關(guān)。見表2。

表2 結(jié)腸癌組織中PD-L1和PD-1的表達與臨床病理特征的關(guān)系

3.討論

PD-l正常表達在CD4—CD8—胸腺細胞上，誘導(dǎo)性表達于活化的T細胞、B細胞、骨髓細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞（NK）、單核細胞等，當(dāng)抗原清除，免疫應(yīng)答完成后，T細胞的PD-l表達減少。PD-l持續(xù)性表達在T細胞上會誘導(dǎo)T細胞的衰竭。因此PD-l屬于免疫抑制受體，而其本身也是活化T細胞的一個標志。PD-L1是PD-l的配體，屬于B7家族中的負性共刺激信號分子，正常生理狀態(tài)下，主要表達于組織細胞、內(nèi)皮細胞、活化T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突細胞等，它與活化T細胞表面PD-l結(jié)合，抑制T細胞活化，誘導(dǎo)T細胞凋亡，使機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)維持在一定動態(tài)平衡［4］。腫瘤發(fā)生時，腫瘤微環(huán)境會誘導(dǎo)浸潤性T細胞高表達PD-1分子，腫瘤細胞高表達PD-L1，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中PD-1通路持續(xù)激活，PD-L1 與PD-1聯(lián)接后，T 細胞功能被抑制，不能向免疫系統(tǒng)發(fā)出攻擊腫瘤的信號［5］。PD-1/PD-L1 抑制劑可以阻斷PD-1與PD-L1 的結(jié)合，阻斷負向調(diào)控信號，使T細胞恢復(fù)活性，從而增強免疫應(yīng)答。已有研究證實多種惡性腫瘤[6-11]，如肺癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、腎細胞癌等均通過表達PD-L1 來誘導(dǎo)形成免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，逃避機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

目前對于PD-1、PD-L1在結(jié)直腸癌中的表達研究較少，本實驗結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中高表達PD-1、PD-L1，其中，PD-1蛋白表達定位于癌間質(zhì)浸潤的淋巴細胞中，陽性率為32.6%，PD-L1蛋白表達主要定位于癌細胞和癌間質(zhì)淋巴細胞，其總體陽性率為65.1%，兩者的表達均高于對照組。并且，PD-1、PD-L1蛋白表達與多項臨床病理特征相關(guān)，癌細胞中PD-L1表達與年齡密切相關(guān)(P＜0.01)，癌間質(zhì)PD-L1表達與年齡、TNM分期以及浸潤深度密切相關(guān)(P＜0.05)。癌組織中PD-1表達與性別和腫瘤大小密切相關(guān)(P＜0.05)。因此推測，結(jié)直腸患者PD-1/PD-L1高表達可以作為PD-1/PD-L1 抑制劑治療的用藥指標，同時聯(lián)合臨床病理參數(shù)，可作為療效評估指標，有助于判斷預(yù)后。另外，本實驗結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中PD-1、PD-L1兩者的蛋白表達呈顯著正相關(guān)(P＜0.001)，此結(jié)果與馬薇［12］、王也［13］在肺癌中的研究一致；在胃癌中，劉書漫［14］等發(fā)現(xiàn)PD-L1與PD-1的表達呈負相關(guān)，而吳圣［15］等的研究結(jié)果則顯示兩者之間的表達不存在明顯的相關(guān)性；張偉［16］等在三陰性乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)間質(zhì)TIL中PD-L1的表達與PD-1表達有相關(guān)性，而腫瘤細胞PD-L 1的表達與PD1表達無相關(guān)性。由此看來，PD-1、PD-L1在不同腫瘤中的表達模式及相關(guān)性有所不同，其意義仍有待進一步研究。