李曉非,劉紅偉,羅風,邱萬
中國為結(jié)核病高流行國家[1],2017年全球新發(fā)結(jié)核病患者約1 000萬例,我國新發(fā)結(jié)核病患者88.9萬,結(jié)核病疫情嚴峻[2-3]??刂品谓Y(jié)核的關(guān)鍵是探索出精準有效的結(jié)核病診斷及治療監(jiān)測新方法[4-5]。但是當前臨床上尚無針對抗癆治療效果快速準確的評估手段,僅僅通過觀察患者的臨床表現(xiàn)及輔助檢查結(jié)果來推斷治療是否有效,特異度及敏感度均較低[6-7]。因此,探索可快速、特異、正確地反映肺結(jié)核抗癆療效的方法已迫在眉睫。結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-cell spot of Tuberculosis,T-SPOT.TB)是根據(jù)酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme-linked immunospot test,ELISPOT)的原理直接檢測并計數(shù)人新鮮外周血中釋放γ-干擾素的結(jié)核特異性抗原[早期分泌靶向抗原 6(earlysecreting antigen target-6,ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein-10,CFP-10)]刺激活化效應(yīng)T細胞數(shù)量的方法,在結(jié)核病診斷方面有較高的價值[8-10]。有研究顯示,隨著抗癆治療進行,機體結(jié)核分枝桿菌數(shù)量降低,患者細胞免疫(抗原特異性免疫)應(yīng)答狀態(tài)隨之改變,繼而可能出現(xiàn)結(jié)核特異性活化效應(yīng)T細胞數(shù)量的不斷減少,即TSPOT.TB結(jié)果的降低,提示T-SPOT.TB有望成為監(jiān)測肺結(jié)核患者早期抗癆治療效果的指標[7,11-13]。目前,國內(nèi)偶有關(guān)于T-SPOT.TB監(jiān)測肺結(jié)核治療效果的報道,且各家研究結(jié)果并不完全一致[6-7,14]?;谝陨蠁栴},本研究通過分析肺結(jié)核患者抗癆治療前后T-SPOT.TB結(jié)果動態(tài)變化趨勢及機體對結(jié)核特異性抗原(ESAT-6、CFP-10)刺激免疫應(yīng)答水平的變化,探討T-SPOT.TB在肺結(jié)核早期抗癆治療有效過程中的變化趨勢,以期為臨床肺結(jié)核抗癆療效評估,探索出切實有效的實驗室監(jiān)測指標。
1.1研究對象 選擇2016年6月—2019年2月在我院結(jié)核科明確診斷為初治活動性肺結(jié)核患者。納入標準:(1)符合中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準-肺結(jié)核診斷(WS 288-2017)[15]。(2)依據(jù)《結(jié)核病治療指南》進行規(guī)范化抗結(jié)核治療[16-17]。(3)初診及隨訪均在我院做T-SPOT.TB檢測。(4)經(jīng)規(guī)范化抗癆治療,依據(jù)臨床表現(xiàn)及輔助檢查判斷為治療有效者。排除標準:(1)來我院就診前已經(jīng)接受過抗結(jié)核治療。(2)隨訪未成功。(3)患有艾滋病、病毒性肝炎、腫瘤等其他疾病導致機體免疫系統(tǒng)受影響者。依據(jù)以上標準,最終納入研究對象50例,男、女各25例,年齡17~65歲,中位年齡27歲。本研究獲昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準,并與患者簽署知情同意書。
1.2主要材料 T-SPOT.TB試劑盒、溫控水平離心機(18~25℃,離心力≥1 800×g)。RPMI-1640培養(yǎng)基(江蘇長星公司)、緩沖液(天津灝洋華科公司)、人外周血淋巴細胞分離液(天津灝洋華科公司)、顯微鏡(奧林巴斯CX-31)、生物安全柜(青島海爾公司)。
1.3試驗方法
1.3.1標本采集 收集患者抗結(jié)核治療前、治療后(30 d、1個月、3個月)血液標本,同時對患者歷次就診時的臨床表現(xiàn)做好詳細記錄。用無菌注射器抽取外周靜脈血5~8 mL至加有肝素鈉的真空采血管中,室溫(18~25℃)保存,4 h內(nèi)完成外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)分離。
1.3.2T-SPOT.TB操作及結(jié)果判讀 試驗操作過程及結(jié)果判讀均按照T-SPOT.TB試劑盒配套說明書嚴格執(zhí)行。準確記錄每1個檢測樣本T-SPOT.TB試驗結(jié)果中ESAT-6抗原孔、CFP-10抗原孔的具體斑點數(shù)值。根據(jù)抗原ESAT-6和/或抗原CFP-10孔的反應(yīng)判斷結(jié)果,陽性結(jié)果參照以下兩條標準中的任意一條:(1)空白對照孔斑點數(shù)為0~5個時:(抗原ESAT-6或抗原CFP-10孔的斑點數(shù))-(空白對照孔斑點數(shù))≥6。(2)空白對照孔斑點數(shù)為6~10個時:(抗原ESAT-6或抗原CFP-10孔的斑點數(shù))≥2×(空白對照孔斑點數(shù))。
1.4療效觀察 患者抗結(jié)核治療采取自行服藥方式,遵醫(yī)囑門診定期復查。臨床表現(xiàn)(如咯血、消瘦、胸痛、發(fā)熱等)持續(xù)緩解及輔助檢查提示病灶消失或鈣化等為有效病例,納入本次研究[18];若抗癆治療后臨床表現(xiàn)及輔助檢查結(jié)果無明顯變化或病情加重,則視為無效病例[19],予以剔除。
1.5質(zhì)量控制 課題數(shù)據(jù)采集前,對相關(guān)專業(yè)人員分別參照《肺結(jié)核診斷標準》(WS 288-2017)、《結(jié)核病治療指南》和TSPOT.TB(免疫斑點法)操作說明書等,統(tǒng)一進行規(guī)范化培訓。嚴格按照納入及排除標準收集數(shù)據(jù),信息調(diào)查留取紙質(zhì)版,采用雙人雙錄方式錄入檢測數(shù)據(jù),請專業(yè)技術(shù)人員進行TSPOT.TB試驗操作且整個操作過程均達到質(zhì)量控制目標。注:《肺結(jié)核診斷標準》(WS 288-2017)未實施之前,本研究入組病例診斷標準參照《肺結(jié)核診斷標準》(WS 288-2008)。
1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)分析處理。不符合正態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示,不同時間點比較采用Friedman秩和檢驗;計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1肺結(jié)核患者抗癆治療有效過程中T-SPOT.TB斑點數(shù)變化趨勢 T-SPOT.TB斑點數(shù)(ESAT-6抗原孔、CFP-10抗原孔、“ESAT-6+CFP-10”抗原孔)在初診行短程標準抗結(jié)核治療前和治療后30 d、1個月、3個月基本呈逐漸降低的趨勢(P<0.05),見圖1、表1。
Fig.1 Trends of T-SPOT.TB results before and after treatment at 0.5,1 and 3 months圖1 治療前和治療后0.5、1、3個月T-SPOT.TB結(jié)果變化趨勢
2.2治療前及治療3個月后機體對ESAT-6、CFP-10刺激應(yīng)答變化趨勢 與治療前相比,機體在治療3個月后對ESAT-6和CFP-10抗原刺激應(yīng)答反應(yīng)均下降。ESAT-6應(yīng)答變化升高占比14.00%(7/50)、降低占比86.00%(43/50);CFP-10應(yīng)答變化升高占比4.00%(2/50)、降低占比96.00%(48/50),治療3個月后機體對ESAT-6、CFP-10應(yīng)答反應(yīng)變化一致(χ2=1.954,P=0.162)。
Tab.1 Comparison of T-SPOT.TB results between different time points表1 不同時間點T-SPOT.TB結(jié)果的差異性比較 [M(P25,P75)]
T-SPOT.TB是利用當機體T淋巴細胞再次受到具有毒力的結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后可活化為分泌結(jié)核分枝桿菌特異性γ-干擾素的效應(yīng)T細胞,檢測并計數(shù)效應(yīng)T細胞數(shù)量,以評估機體是否被結(jié)核分枝桿菌感染的一種手段;該試驗中的抗原在致病結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)上:Rv3874編碼的CFP-10抗原和Rv3875編碼的ESAT-6抗原[20-23]。有研究顯示,結(jié)核分枝桿菌抗原特異性效應(yīng)T細胞一旦失去致病菌的刺激就會很快凋亡,且結(jié)核病患者若不進行任何臨床干預,其T-SPOT.TB結(jié)果不變;但隨著抗癆治療的有效進行,機體結(jié)核分枝桿菌抗原特異性細胞免疫應(yīng)答水平隨之改變,效應(yīng)T細胞數(shù)量會隨著機體內(nèi)細菌載量的下降而下降[24-25];說明TSPOT.TB結(jié)果可能會隨著患者抗癆治療病情好轉(zhuǎn)而不斷降低甚至轉(zhuǎn)陰,從而進一步提示T-SPOT.TB可能成為評估活動性肺結(jié)核抗癆治療效果的一個新的敏感指標[26-29]。
本次初步研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB斑點數(shù)在肺結(jié)核早期抗癆治療有效過程中呈下降趨勢。吳家寶等[12]對9例活動性肺結(jié)核患者也進行了4個時間點(治療前,治療后2、4、6個月)的追蹤觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著抗癆治療地有效進行,結(jié)核分枝桿菌抗原特異性淋巴細胞的數(shù)量隨著機體致病菌負荷的下降而變化。Park等[30]觀察并記錄確診的33例活動性肺結(jié)核患者抗癆治療前及治療結(jié)束時的數(shù)據(jù),分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESAT-6和CFP-10的平均斑點計數(shù)分別下降了27和24,指出隨著抗癆治療地有效進行,T-SPOT.TB結(jié)果明顯下降。以上研究結(jié)果均與本研究結(jié)果相似。Wang等[29]對13例正在抗癆治療的肺外結(jié)核患者進行了連續(xù)T-SPOT.TB檢測,發(fā)現(xiàn)在抗癆治療6個月后,ESAT-6和CFP-10抗原孔斑點數(shù)無明顯下降(P=0.191,P=0.061)。汪鍇等[24]對62例脊柱結(jié)核患者進行了5個時間點(抗癆治療前、1、3、6和12個月)的追蹤隨訪,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在后4個時間點統(tǒng)計TSPOT.TB結(jié)果轉(zhuǎn)陰人數(shù)/臨床癥狀緩解人數(shù)比值分別為0、8.3%、22.0%和51.3%,提示該試驗不可用于評估脊柱結(jié)核療效。以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果不一致,考慮原因可能為:(1)入組樣本量均較少。(2)研究追蹤隨訪時間不同。(3)研究結(jié)核感染部位及病種差異。(4)研究人群的地域及遺傳背景差異。(5)采用T-SPOT.TB判斷疾病預后的視角不同等。
本研究還發(fā)現(xiàn),經(jīng)過3個月治療,機體對ESAT-6、CFP-10刺激應(yīng)答水平變化一致。何紫琪等[6]對113例結(jié)核病患者治療前、后CFP-10和ESAT-6應(yīng)答變化趨勢分析發(fā)現(xiàn),治療前、后機體對CFP-10和ESAT-6抗原應(yīng)答變化有差異,結(jié)核病治療的有效監(jiān)測手段是CFP-10的定量應(yīng)答,與本研究結(jié)果存在差異。Ewer等[31]對38例結(jié)核菌素皮膚試驗陽性者進行研究發(fā)現(xiàn),其接受3個月預防性抗癆治療后,RD1區(qū)特異性T細胞反應(yīng)顯著下降,其中16%的患者在隨訪期間出現(xiàn)RD1區(qū)特異性T細胞反應(yīng)呈陰性,該現(xiàn)象可能反映了預防性抗癆治療期間活桿菌數(shù)量的減少,此研究與本研究結(jié)果基本相符。Aiken等[32]研究發(fā)現(xiàn),抗癆治療1年后,機體對CFP-10和ESAT-6刺激的應(yīng)答反應(yīng)降低,伴隨著結(jié)核病的成功治療,結(jié)核分枝桿菌特異性抗原斑點計數(shù)顯著下降,提示ELISPOT試驗具有成為衡量結(jié)核病治療效果的潛力。目前關(guān)于肺結(jié)核患者抗癆治療過程中機體對ESAT-6、CFP-10刺激應(yīng)答水平變化的研究略少,考慮到此研究現(xiàn)狀,分析各研究結(jié)果差異的原因可能是:(1)不同學者對研究對象的追蹤觀察時間點各不相同。(2)不同患者由于遺傳背景不同,個體存在較大差異。(3)不同科研團隊檢測技術(shù)水平差異。(4)樣本量差異導致結(jié)果偏移。(5)研究對象的入組標準、病種及分組差異等。
目前T-SPOT.TB試驗已在世界各地許多實驗室得到廣泛應(yīng)用,關(guān)于探索T-SPOT.TB是否能成為肺結(jié)核療效監(jiān)測有效指標方面仍存在爭議,不同研究從不同的視角出發(fā),探索出其監(jiān)測結(jié)核病療效的結(jié)論也存在較大差異。本研究從探索T-SPOT.TB斑點計數(shù)在肺結(jié)核早期抗癆治療有效過程中的變化趨勢這一視角出發(fā),得出T-SPOT.TB斑點數(shù)在肺結(jié)核早期抗癆治療有效過程中呈下降趨勢;治療前與抗癆治療有效后(第3個月時)機體對ESAT-6、CFP-10刺激應(yīng)答水平變化一致的結(jié)論。本研究為探索TSPOT.TB是否能成為肺結(jié)核抗癆療效監(jiān)測的良好指標進行了初步嘗試。但由于本研究的標本量較少、追蹤觀察時間略短、入組人群缺少治療失敗或治療期間病情反復的患者等不足,可能會使研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚,未來仍需更全面、大樣本(尤其是抗癆治療無效結(jié)核病患者)、多中心的前瞻性病例對照研究,為探索T-SPOT.TB是否能成為肺結(jié)核療效監(jiān)測的良好指標提供更全面的數(shù)據(jù)支持。