黃潔媛，劉文明

既往研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)繼發(fā)的免疫失衡是重癥感染病理生理過(guò)程的重要特點(diǎn)，也是重癥感染患者病情加重的重要原因［1］。肺部嚴(yán)重感染時(shí)極易誘發(fā)急性肺損傷，這與機(jī)體免疫防御機(jī)制過(guò)度激活、促炎/抑炎反應(yīng)失衡和氧化應(yīng)激損傷有關(guān)［2］。因此在抗感染的基礎(chǔ)上，恢復(fù)促炎/抑炎反應(yīng)平衡，阻斷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是急性肺損傷早期治療的關(guān)鍵。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4是重要的抑炎細(xì)胞因子，由CD4+T細(xì)胞分泌，對(duì)淋巴細(xì)胞的遷移具有重要作用。既往已有研究證明，IL-4可以下調(diào)炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，降低嚴(yán)重感染小鼠的死亡率［3］，但是其抑炎機(jī)制目前尚未明了。髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是Toll樣受體信號(hào)通路中的重要接頭分子，可以與核因子（NF）-κB形成炎癥反應(yīng)通路，導(dǎo)致NF-κB p65蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，從而誘導(dǎo) IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，放大炎癥信號(hào)。MyD88/NF-κB信號(hào)通路在感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展中占有重要地位［4-5］。已有研究證明，IL-4可以抑制IκB激酶（IKK）的活性，進(jìn)而抑制NF-κB活化。另外，IL-4對(duì)NF-κB的作用不僅局限于下游水平，對(duì)上游也會(huì)造成影響［6-7］。因此筆者推測(cè)，IL-4可能作用于MyD88/NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而影響NF-κB活性及p65蛋白的核移位以下調(diào)炎癥反應(yīng)。本研究以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）啟動(dòng)小鼠巨噬細(xì)胞株Ana-1的炎癥反應(yīng)，分析IL-4預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞MyD88/NF-κB信號(hào)通路的影響，探討IL-4抑制炎癥的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司（貨號(hào)XY-M001）；小鼠IL-4購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司（貨號(hào)130-097-760）；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自杭州仟諾生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司；兔抗鼠MyD88和NF-κB p65單克隆抗體購(gòu)自上海生物工程有限公司；羊抗兔生物素化IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司；小鼠TNF-α和IL-6酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海哈靈生物科技公司；小鼠NF-κB p65 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技公司；胞漿和胞核蛋白提取試劑盒購(gòu)于武漢博士德有限公司。ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI），半干轉(zhuǎn)印儀（Bio-Rad），垂直電泳儀（Bio-Rad），HBS-1096A酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和構(gòu)建LPS±IL-4處理Ana-1細(xì)胞模型 Ana-1巨噬細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)含10%滅活胎牛血清、100 U/mL鏈霉素和100 mg/L青霉素，37℃，5%CO2常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，隔日換液。當(dāng)細(xì)胞貼壁融合度達(dá)到90%以上時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行傳代。傳代細(xì)胞接種于6孔板（1×106個(gè)/孔）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ana-1巨噬細(xì)胞，將6孔板中的Ana-1細(xì)胞分為2組：分別為L(zhǎng)PS組（給予50μg/L LPS刺激）、LPS+IL-4組（10μg/L IL-4預(yù)培養(yǎng)1 h后給予LPS刺激）。在0、0.5、1和2 h時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平 TRIzol法提取Ana-1巨噬細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分別進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成并提供，序列見(jiàn)表1。RT-PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本至少重復(fù)3次。2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

Tab.1 The primer sequence of MyD88,NF-κB and actin表1 RT-PCR引物序列

1.2.3Western blot檢測(cè)MyD88和NF-κB蛋白表達(dá)水平 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取總蛋白、胞漿蛋白和胞核蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取20μL樣品加入5×SDS緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性。經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗（兔抗鼠MyD88或NF-κB p65單克隆抗體，1∶1 000），4 ℃過(guò)夜，棄去一抗，TBST洗膜3次，每次5 min。室溫孵育二抗（羊抗兔生物素化IgG，1∶1 000）2 h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min。ECL顯色，同期以β-actin作內(nèi)參。顯影后通過(guò)Quantity One軟件分析各條帶，以各條帶與內(nèi)參吸光度的比值表示MyD88/NF-κB p65的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4ELISA檢測(cè)NF-κB p65胞核/胞漿比例 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取胞漿蛋白和胞核蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。按照NF-κB p65 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)NF-κB p65在細(xì)胞核及細(xì)胞漿中的含量，檢測(cè)時(shí)波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm，并計(jì)算NF-κB p65胞核/胞漿比例。

1.2.5ELISA檢測(cè)IL-6和TNF-α含量 收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照TNF-α和IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行IL-6和TNF-α含量的檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組不同時(shí)間點(diǎn)間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，同一時(shí)間點(diǎn)組間比較行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IL-4對(duì)LPS活化的Ana-1細(xì)胞表達(dá)MyD88的影響 隨著Ana-1細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，LPS組MyD88 mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈逐漸升高趨勢(shì)（P＜0.05）。而LPS+IL-4組MyD88 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），MyD88蛋白表達(dá)水平則呈先升高后下降趨勢(shì)（在0.5 h時(shí)最高，2 h時(shí)下降至最低）。LPS+IL-4組MyD88 mRNA和蛋白表達(dá)水平在0 h和0.5 h時(shí)與LPS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在1 h和2 h時(shí)顯著低于LPS組（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 IL-4對(duì)LPS活化的Ana-1細(xì)胞表達(dá)MyD88蛋白的影響

2.2IL-4對(duì)LPS活化的Ana-1細(xì)胞NF-κB表達(dá)的影響 隨著Ana-1細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論是LPS組還是LPS+IL-4組，NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)（P＜0.05）。而2組不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 IL-4對(duì)LPS活化的Ana-1細(xì)胞表達(dá)NF-κB蛋白的影響

Tab.2 Effects of IL-4 on the mRNA and protein expression of MyD88 in LPS-activated Ana-1 cells表2 IL-4對(duì)LPS活化的Ana-1細(xì)胞表達(dá)MyD88 mRNA和蛋白的影響 （n=5，±s）

Tab.2 Effects of IL-4 on the mRNA and protein expression of MyD88 in LPS-activated Ana-1 cells表2 IL-4對(duì)LPS活化的Ana-1細(xì)胞表達(dá)MyD88 mRNA和蛋白的影響 （n=5，±s）

＊P＜0.05；a與0 h比較，b與0.5 h比較，c與1 h比較，P＜0.05

組別LPS組LPS+IL-4組t MyD88 mRNA 0 h 1.30±0.34 1.26±0.48 0.152 0.5 h 1.68±0.12 1.72±0.43 0.200 1 h 2.14±0.30a 1.52±0.21 3.786＊2 h 2.67±0.43ab 1.21±0.14 3.063＊F 10.372＊1.415 MyD88蛋白（%）0 h 7.36±0.61 7.29±1.01 0.133 0.5 h 15.37±0.44a 16.01±0.84a 1.509 1 h 17.00±0.81ab 12.64±0.32ab 11.942＊2 h 19.37±1.24abc 7.01±0.97abc 17.555＊F 117.998＊82.627＊

Tab.3 Effects of IL-4 on the mRNA and protein expression of NF-κB in LPS-activated Ana-1 cells表3 IL-4對(duì)LPS活化的Ana-1細(xì)胞表達(dá)NF-κB mRNA和蛋白的影響 （n=5，±s）

Tab.3 Effects of IL-4 on the mRNA and protein expression of NF-κB in LPS-activated Ana-1 cells表3 IL-4對(duì)LPS活化的Ana-1細(xì)胞表達(dá)NF-κB mRNA和蛋白的影響 （n=5，±s）

＊P＜0.05；a與0 h比較，b與0.5 h比較，c與1 h比較，P＜0.05

組別LPS組LPS+IL-4組t NF-κB mRNA 0 h 0.68±0.09 0.70±0.12 0.298 0.5 h 1.34±0.09a 1.29±0.11a 0.787 1 h 1.99±0.11ab 1.87±0.20ab 1.176 2 h 2.24±0.27ab 2.12±0.33ab 0.629 F 58.106＊27.487＊NF-κB蛋白（%）0 h 2.35±0.32 2.40±0.27 0.267 0.5 h 9.31±0.28a 8.84±0.41a 2.117 1 h 15.33±0.82ab 16.29±0.52ab 2.211 2 h 20.33±0.69abc 19.32±1.07abc 1.774 F 543.807＊419.734＊

2.3NF-κB p65胞核/胞漿比例變化 隨著Ana-1細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，LPS組NF-κB p65胞核/胞漿比例呈逐漸上升的趨勢(shì)（P＜0.05）；而LPS+IL-4組呈先上升后下降的趨勢(shì)（P＜0.05）。LPS+IL-4組NF-κB p65胞核/胞漿比例在0 h和0.5 h時(shí)與LPS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在1 h和2 h時(shí)明顯低于LPS組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

2.4IL-4對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-6和TNF-α水平的影響 隨著Ana-1細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，LPS組IL-6和TNF-α水平呈逐漸升高的趨勢(shì)（P＜0.05）；LPS+IL-4組則呈先升高后下降的趨勢(shì)（P＜0.05）。LPS+IL-4組IL-6和TNF-α水平在0 h和0.5 h時(shí)與LPS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在1 h和2 h時(shí)明顯低于LPS組（P＜0.05），見(jiàn)表5。

Tab.4 Changes of nuclear/cytoplasmic ratio of NF-κB p65表4 NF-κB p65胞核/胞漿比例變化 （n=5，±s）

Tab.4 Changes of nuclear/cytoplasmic ratio of NF-κB p65表4 NF-κB p65胞核/胞漿比例變化 （n=5，±s）

＊P＜0.05；a與0 h比較，b與0.5 h比較，c與1 h比較，P＜0.05

組別LPS組LPS+IL-4組t 0 h 0.35±0.10 0.34±0.07 0.183 0.5 h 1.21±0.09a 1.05±0.14a 2.149 1 h 1.87±0.15ab 1.06±0.30a 5.400＊2 h 2.71±0.28abc 0.49±0.11bc 16.501＊F 100.931＊13.299＊

Tab.5 Effects of IL-4 on the levels of IL-6 and TNF-α in LPS-activated Ana-1 cells表5 IL-4對(duì)LPS誘導(dǎo)的Ana-1細(xì)胞中IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平的影響 （ng/L，n=5，±s）

Tab.5 Effects of IL-4 on the levels of IL-6 and TNF-α in LPS-activated Ana-1 cells表5 IL-4對(duì)LPS誘導(dǎo)的Ana-1細(xì)胞中IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平的影響 （ng/L，n=5，±s）

＊P＜0.05；a與0 h比較，b與0.5 h比較，c與1 h比較，P＜0.05

組別LPS組LPS+IL-4組t IL-6 0 h 60.21±22.58 60.08±18.37 0.01 0.5 h 193.26±17.68a 189.47±24.31a 0.282 1 h 245.36±22.58ab 164.21±15.24a 6.665＊2 h 276.34±26.00ab 142.36±18.67ab 9.359＊F 56.847＊24.972＊TNF-α 0 h 47.25±8.31 46.85±6.37 0.085 0.5 h 211.64±24.80a 208.36±30.33a 0.187 1 h 298.31±40.02ab 176.34±18.64a 6.155＊2 h 381.11±21.22abc 163.24±14.08ab 19.13＊F 89.495＊39.592＊

3 討論

抗炎細(xì)胞因子IL-4主要由CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的，可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活性并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能。研究表明，IL-4對(duì)B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞都有免疫調(diào)節(jié)作用［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，重癥肺炎患者血清中IL-4水平明顯升高，提示IL-4可能參與了機(jī)體的抗炎過(guò)程［9-10］，但其具體抗炎機(jī)制尚未明確。

本研究采用LPS刺激Ana-1細(xì)胞以激活NF-κB炎癥信號(hào)通路，結(jié)果顯示，在LPS的誘導(dǎo)下，小鼠炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型建立成功：MyD88和NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高，NF-κB p65蛋白核移位增加，同時(shí)上調(diào)了細(xì)胞中IL-6和TNF-α的表達(dá)，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道的LPS誘導(dǎo)發(fā)生的炎癥反應(yīng)表現(xiàn)一致［11-12］。Toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號(hào)通路是LPS胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵途徑。LPS通過(guò)與TLR4結(jié)合，從而誘導(dǎo)TLR4聚合使得信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，胞內(nèi)TIR區(qū)與MyD88的羧基端結(jié)合，同時(shí)MyD88通過(guò)氨基端的死亡域與白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（IRAK）的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活I(lǐng)RAK的自身磷酸化，獲得游離的IRAK繼而激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6（TRAF-6），TRAF-6激活NF-κB二聚體的抑制蛋白家族（IκB）激酶（IKKs）。IκB由于磷酸化、泛素化后降解，使得NF-κB從靜息狀態(tài)下受IκB結(jié)合處于的抑制狀態(tài)解除，進(jìn)而導(dǎo)致NF-κB p65轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)［13-15］。

Lai等［16］研究顯示，IL-4可通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，影響其mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而下調(diào)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究通過(guò)加入IL-4進(jìn)行干預(yù)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，在IL-4干預(yù)下，MyD88的mRNA和蛋白表達(dá)水平呈先升高后下降的趨勢(shì)，提示LPS誘導(dǎo)下NF-κB激活導(dǎo)致p65入核增加，使得NF-κB p65胞核/胞漿比例增高；在IL-4的干擾下，進(jìn)入胞核的p65蛋白減小，活化受到抑制，從而導(dǎo)致NF-κB p65胞核/胞漿比例的下調(diào)。

此外，本研究結(jié)果顯示，在IL-4的干擾下，促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α表達(dá)水平也隨之出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。而IL-4作用下的TLR4/NF-κB信號(hào)通路中只有MyD88發(fā)生顯著變化，提示IL-4可能通過(guò)抑制MyD88而下調(diào)NF-κB活性，從而影響IL-6和TNF-α的表達(dá)，抑制LPS啟動(dòng)的炎癥反應(yīng)。MyD88作為T(mén)LR4/NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵接頭分子，已有研究表明在MyD88基因敲除小鼠中，LPS并不能使血清中IL-6和TNF-α水平增加［17］，提示MyD88在LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，而本研究結(jié)果進(jìn)一步提示IL-4可能作用于MyD88而參與抗炎反應(yīng)。

綜上，本研究通過(guò)構(gòu)建IL-4干擾的LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)IL-4可以逆轉(zhuǎn)由于LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的表達(dá)上調(diào)，可能具有抗炎作用。此外通過(guò)檢測(cè)MyD88/NF-κB信號(hào)通路中MyD88和NF-κB的表達(dá)和NF-κB p65的核移位，發(fā)現(xiàn)IL-4參與的抗炎機(jī)制可能與該通路中MyD88的表達(dá)下調(diào)及NF-κB p65蛋白的核移位有關(guān)。但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。