趙 娟，魏 星，楊 婷，趙敏伊，裴美麗，楊筱鳳

1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710061 2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710004

宮頸癌是女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，根據(jù)我國2015年的癌癥統(tǒng)計報告，每10萬名女性中會有98.9名被診斷為宮頸癌，其中會有約30.5人死于此病[2]。已證實高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌的觸發(fā)因素，但是病毒的持續(xù)慢性感染如何演變成癌的具體機制仍有待進(jìn)一步探索，致癌機制研究成果的不斷明確利于從預(yù)防到治療的全方位科技轉(zhuǎn)化，為精準(zhǔn)預(yù)防宮頸癌奠定理論基礎(chǔ)。

基因啟動子區(qū)CG島高甲基化是基因表達(dá)沉默非常重要的機制之一，也是宮頸疾病向癌癥進(jìn)展過程中最主要的早期常見事件[3]。高甲基化導(dǎo)致的抑癌基因表達(dá)失活在宮頸病變各個階段從低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)到浸潤癌都存在。我們在前期研究中利用高通量測序及GO功能分析，發(fā)現(xiàn)了宮頸癌組織基因ATG4B、SALL3、SOX11、PCDHB4等基因發(fā)生了異常甲基化，其中SALL3基因影響細(xì)胞及組織的生長發(fā)育進(jìn)程。目前關(guān)于SALL3基因甲基化與宮頸癌關(guān)系的研究報道較少。本研究擬通過檢測宮頸癌中SALL3基因啟動子甲基化狀態(tài)，分析其與SALL3表達(dá)水平相關(guān)性，探討可能的生物學(xué)功能及臨床應(yīng)用價值。

材料和方法

宮頸組織標(biāo)本來源18例宮頸組織標(biāo)本均來自2012年4月至2014年12月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科住院患者，中位年齡44歲(27～63歲)。10例宮頸癌患者術(shù)前經(jīng)活檢確診，未接受放療及化療，臨床分期為Ⅰa2～Ⅱa1期，其中1例為HPV陰性，手術(shù)行廣泛全子宮切除+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)后再次病理證實且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。8例對照組患者行全子宮切除術(shù)，術(shù)后病理確診無宮頸病變，其中1例為HPV陽性。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸鱗癌細(xì)胞株SiHa及人宮頸腺癌細(xì)胞株HeLa來自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心細(xì)胞實驗室，在37℃、5 %CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10 %胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)。均取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

甲基化特異性PCR提取基因組DNA，進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，利用NCBI Map Viewer在線軟件尋找SALL3基因第1外顯子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始ATG上游約2000～3000 bp至下游200 bp序列作為基因的啟動子區(qū)序列，通過Meth Primer在線軟件預(yù)測啟動子區(qū)的CG島及針對CG島設(shè)計用于甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MS-PCR)擴(kuò)增的引物。SALL3-MF：ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTCGTC；SALL3-MR：ATAACCTCCTAAAACTTCCCCGAA。引物設(shè)計完成后由日本Takara公司合成。引物使用前12 000 r/min(r= 10 cm)瞬時離心，按照合成說明書所標(biāo)示的摩爾濃度加入相應(yīng)的TE溶液，使引物終濃度為100 μmol/L，分裝并于-20℃保存；進(jìn)行反應(yīng)時將引物稀釋至工作濃度10 μmol/L。配制反應(yīng)液，按照設(shè)定的反應(yīng)條件進(jìn)行MS-PCR。

Real-time PCR制備cDNA樣品，設(shè)計Real-time PCR引物，SALL3-F：CAAAGCGAGCTCAGAAACAG；SALL3-R：CCTGATGCTCCAACTTCAAA。引物設(shè)計完成后由日本Takara公司合成。引物使用前12 000 r/min(r=10 cm)瞬時離心，按照合成說明書所標(biāo)示的摩爾濃度加入相應(yīng)體積的TE溶液，使引物終濃度為100 μmol/L，分裝并于-20℃保存；進(jìn)行PCR反應(yīng)時將引物稀釋至工作濃度10 μmol/L。配制反應(yīng)液體系進(jìn)行Real-time PCR。

5-Azacytidine去甲基化處理宮頸癌細(xì)胞系取對數(shù)生長期的宮頸癌細(xì)胞系SiHa及HeLa細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液離心后制備成細(xì)胞懸液，吸取10 μl進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按每孔1.0×105個細(xì)胞接種SiHa和HeLa細(xì)胞過夜培養(yǎng)；取出接種上述細(xì)胞的6孔板，加入含有5-Azacytidine的新鮮培養(yǎng)基于各孔中，使其終濃度分別為0、5、10 μmol/L，37℃孵育箱培養(yǎng)；每24 h更換1次含有相同濃度5-Azacytidine的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)72 h后取出提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行下一步實驗。

Western blot收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，每個樣本按同一總蛋白量上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5 %脫脂牛奶室溫?fù)u床孵育2 h，TBST漂洗3遍，加入一抗(抗SALL3，1∶1000)4℃孵育過夜，次日TBST漂洗3遍，加入羊抗兔二抗(1∶1000)室溫?fù)u床孵育1 h，ECL顯色。以β-Actin作為內(nèi)參，用內(nèi)參進(jìn)行灰度值的矯正，進(jìn)行目的灰度和內(nèi)參灰度的比值比較。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計量資料以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗、Kruskal-WallisH-檢驗；所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

宮頸癌組織中SALL3啟動子區(qū)高甲基化抑制SALL3的表達(dá)選取10例宮頸癌組織及相應(yīng)的癌旁組織，8例正常宮頸組織，采用MS-PCR的方法檢測宮頸組織中SALL3基因啟動子區(qū)的甲基化表達(dá)水平，結(jié)果顯示，宮頸癌和癌旁組織中的SALL3基因啟動子區(qū)甲基化水平分別為0.60(IQR：0.73，秩均值：16.70)(P=0.046)和0.82(IQR：0.50，秩均值：17.15)(P=0.039)，均顯著高于正常宮頸組織的0.03(IQR：0.39，秩均值：8.44)(圖1)。同時采用Western blot的方法檢測SALL3在蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示，SALL3在宮頸癌及癌旁組織中的表達(dá)分別為0.10(IQR：0.17，秩均值：8.40)(P=0.012)和0.26(IQR：0.21，秩均值：15.6)(P=0.000)，均顯著低于正常宮頸組織的0.57(IQR：0.73，秩均值：20.75)(圖2)。

SALL3在宮頸細(xì)胞系HeLa及SiHa中的甲基化水平利用MethPrimer在線軟件預(yù)測SALL3第1外顯子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點ATG上游約2000～3000 bp，至下游200 bp范圍內(nèi)的啟動子區(qū)CG島數(shù)量(圖3A)，在SALL3基因的啟動子區(qū)幾乎均由CG島覆蓋，是甲基化的高發(fā)區(qū)域。在CG島范圍內(nèi)隨機設(shè)計甲基化及非甲基化的引物，利用MSP檢測該位點在宮頸癌細(xì)胞中的甲基化表達(dá)水平。結(jié)果顯示，SALL3啟動子區(qū)在HeLa中為部分甲基化，而在SiHa中為完全甲基化(圖3B)。

5-Azacytidine去甲基化處理宮頸癌細(xì)胞后SALL3基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，給予0、5、10 μmol/L 5-Azacytidine去甲基化處理HeLa及SiHa細(xì)胞后，HeLa(F=28.704，P=0.001)和SiHa細(xì)胞(F=29.783，P=0.002)中SALL3 mRNA的表達(dá)水平均隨5-Azacytidine作用濃度的升高而升高，且在SALL3啟動子區(qū)檢測位點甲基化水平最高的SiHa細(xì)胞中經(jīng)過去甲基化處理后SALL3 mRNA表達(dá)逆轉(zhuǎn)的最為顯著(表1)。

CCa：宮頸癌組織；CCap：宮頸癌旁組織；NC：正常宮頸組織；M：甲基化；U：非甲基化
CCa：cervical cancer；CCap：para-cervical cancer tissue；NC：normal cervical tissue；M：methylation；U：unmethylated
A.宮頸癌及癌旁組織中SALL3基因啟動子區(qū)甲基化水平；B.正常宮頸組織中SALL3基因啟動子區(qū)甲基化水平；C.灰度分析結(jié)果(CCa比CCap：P=0.046；CCa比NC：P=0.039)
A.methylation levels of SALL3 gene promoter region in cervical cancer and para-cervical cancer tissue；B.methylation level of SALL3 gene promoter region in normal cervical tissues；C.grayscale analysis result(CCavs.CCap：P=0.046；CCa vs.NC：P=0.039)
圖1宮頸組織中SALL3基因啟動子區(qū)的甲基化水平
Fig1Methylation level of the SALL3 gene promoter region in cervical tissues

A.宮頸癌及癌旁組織中SALL3的表達(dá)；B.正常宮頸組織中SALL3的表達(dá)；C.灰度分析結(jié)果(CCa比CCap：P=0.012；CCa比NC：P=0.000)
A.expression of SALL3 in cervical cancer and para-cervical cancer tissues；B.expression of SALL3 in normal cervical；C.grayscale analysis result(CCavs.CCap：P=0.012；CCavs.NC：P=0.000)
圖2宮頸組織中SALL3的表達(dá)
Fig2Expression of SALL3 in cervical tissues

A.SALL3基因啟動子區(qū)預(yù)測的CG島，藍(lán)色區(qū)域所示為CG島，紅色豎線所示為輸入序列中的CG二核苷酸位點；B、C.甲基化特異性PCR檢測HeLa及SiHa細(xì)胞系中SALL3的甲基化表達(dá)情況及灰度分析
A.the CG island predicted by the promoter region of the SALL3 gene，the blue region shows the CG island and the red vertical line shows the CG dinucleotide site in the input sequence；B，C.methylation expression and gray scale analysis of SALL3 in HeLa and SiHa cell lines by methylation-specific PCR
圖3宮頸癌細(xì)胞系中SALL3基因啟動子區(qū)甲基化表達(dá)水平
Fig3Methylation expression level of SALL3 gene promoter region in cervical cancer cell lines

宮頸組織中高危型HPV感染與SALL3表達(dá)的相關(guān)性將所選標(biāo)本按照是否存在高危型HPV感染進(jìn)行分組，檢測HPV陰性和陽性組織中SALL3的甲基化水平和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，HPV陰性宮頸組織中SALL3基因啟動子區(qū)甲基化水平明顯低于陽性宮頸組織(P=0.014)(圖4A)；HPV陰性宮頸組織中SALL3的蛋白表達(dá)水平明顯高于陽性宮頸組織(P=0.021)(圖4B)。

表1 不同劑量5-Azacytidine去甲基化處理后HeLa及SiHa細(xì)胞中SALL3mRNA相對表達(dá)量Table 1 Relative expression levels of SALL3 mRNA in HeLa and SiHa cells after different levels of 5-Azacytidine demethylation treatment

討 論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展涉及原癌基因的激活和抑癌基因的失活，后者可引起基因表達(dá)異常和染色體的不穩(wěn)定性增加，表觀遺傳學(xué)改變參與了調(diào)控基因表達(dá)，在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。宮頸癌的表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在癌變進(jìn)程中，多個基因CG島甲基化水平從1%升高至10%[4]。Han等[5]研究發(fā)現(xiàn)，P16INK4a啟動子區(qū)高甲基化是引起該基因表達(dá)下調(diào)的主要機制之一，其甲基化程度由LSIL、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)到浸潤性宮頸癌及晚期宮頸癌呈顯著性升高的趨勢，因此也能夠作為潛在的預(yù)測疾病進(jìn)展的表觀遺傳標(biāo)記。Cicchini等[6]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL14在宮頸癌中因HPV E7癌蛋白和基因啟動子區(qū)高甲基化的協(xié)同作用使之表達(dá)顯著降低，進(jìn)而抑制了其抗腫瘤的免疫反應(yīng)，在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要的促進(jìn)作用。此外，高甲基化也可能通過模擬Knudson的“二次打擊”學(xué)說，而并不需要發(fā)生異染色質(zhì)缺失便可導(dǎo)致基因表達(dá)失活[7]。事實上，高甲基化和基因沉默能夠影響幾乎所有的信號通路，如細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞黏附、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。

SALL3是SAL家族成員之一，其基因定位于18q23，編碼sal樣C2H2型鋅指蛋白。該家族中基因發(fā)生突變與人類先天性疾病的發(fā)生有關(guān)，因此提示該家族基因編碼的蛋白在胚胎發(fā)育中有重要的作用[8-9]。以往研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中，SALL3基因啟動子的甲基化水平高于正常肝細(xì)胞組織的甲基化水平，且其mRNA在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于正常肝組織[10]。在CD133陽性的結(jié)直腸癌細(xì)胞中，SALL3 mRNA的表達(dá)顯著高于CD133陰性的結(jié)直腸癌細(xì)胞[11]，并且高通量甲基化測序結(jié)果顯示SALL3可能作為結(jié)直腸癌診斷的潛在標(biāo)記物[12]。此外，前期研究已證實SALL3的異常高甲基化會導(dǎo)致其腫瘤抑制因子的功能失活，協(xié)同HPV感染可能促成宮頸癌的癌發(fā)生[13]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織合癌旁組織中，SALL3基因啟動子區(qū)的甲基化水平顯著高于正常宮頸組織，并且這種異常高甲基化的表達(dá)狀態(tài)抑制了其下游轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)，使得SALL3蛋白在宮頸癌及癌旁組織中的表達(dá)低于正常宮頸組織。本研究在啟動子區(qū)CpG設(shè)計甲基化引物，采用MS-PCR檢測了宮頸癌細(xì)胞系HeLa及SiHa中SALL3的甲基化情況，結(jié)果顯示，在HeLa及SiHa中該位點發(fā)生了明顯甲基化，且在SiHa中發(fā)生了完全甲基化。在上述細(xì)胞系中加入不同濃度的5-Azacytidine去甲基化處理后，SALL3 mRNA的表達(dá)隨著5-Azacytidine濃度的增加而增加，說明5-Azacytidine能夠去除了SALL3的甲基化，在轉(zhuǎn)錄水平逆轉(zhuǎn)并促進(jìn)了SALL3的表達(dá)。因此，在宮頸癌細(xì)胞中，SALL3基因的轉(zhuǎn)錄受其啟動子區(qū)CpG島甲基化的調(diào)控而表達(dá)降低，在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中可能起到了促進(jìn)作用。目前國內(nèi)外關(guān)于宮頸癌中SALL3相關(guān)研究較少，本研究結(jié)果揭示了SALL3在宮頸癌中的甲基化情況及基因表達(dá)水平，與前期研究結(jié)果及其他腫瘤中的研究結(jié)果具有一致性。

HPV：人乳頭瘤病毒
HPV：human papillomavirus
A.HPV陰性及HPV陽性宮頸組織中SALL3基因啟動子區(qū)甲基化表達(dá)水平；B.HPV陰性及HPV陽性宮頸組織中SALL3蛋白的表達(dá)灰度分析
A.methylation expression level of SALL3 gene promoter region in HPV-negative and HPV-positive cervical tissues；B.grayscale analysis of SALL3 protein expression in HPV-negative and HPV-positive cervical tissues
圖4SALL3與HPV感染的相關(guān)性
Fig4Correlation between SALL3 and HPV infection

高危型HPV的E6和E7蛋白是引起宮頸癌最重要的癌蛋白，通過參與多種細(xì)胞信號和調(diào)控通路，引起宮頸癌的發(fā)生和進(jìn)展[14]。本研究在宮頸組織中分析了HPV感染狀態(tài)與SALL3甲基化及蛋白表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HPV陽性組織的SALL3的甲基化水平明顯高于陰性組織，蛋白表達(dá)水平則明顯低于陰性組織，因此我們推測HPV感染并整合入宿主基因組的機制并不是無序的，而是有針對性的作用于靶蛋白。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌中，SALL3基因的轉(zhuǎn)錄受其啟動子區(qū)CpG島甲基化的調(diào)控而表達(dá)降低，在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中可能起到了促進(jìn)作用。SALL3基因啟動子區(qū)甲基化水平與HPV感染具有相關(guān)性，HPV通過特定的調(diào)控機制調(diào)控SALL3基因啟動子區(qū)的甲基化和表達(dá)，進(jìn)一步影響宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。這些結(jié)果雖然尚不能明確HPV與SALL3之間的時間、空間作用關(guān)系，但是結(jié)合HPV感染、檢測組織樣本中SALL3啟動子區(qū)的甲基化和表達(dá)，也許是今后宮頸癌篩查和早期診斷的潛在甲基化生物學(xué)指標(biāo)。