張松林，范粉靈，魏 峰，王 軍，張玉順

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)構(gòu)性心臟病科，西安710061

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是由反復(fù)或持續(xù)性心肌缺血引起的結(jié)果，主要表現(xiàn)為纖維結(jié)締組織增多、彈性變差、實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少，最終導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)破壞、功能衰竭[1]。微小RNA(microRNA，miRs)是一類大小約為18～25個(gè)核苷酸的RNA，其作用機(jī)制為通過促進(jìn)靶基因mRNA的降解或者抑制靶基因的翻譯來抑制靶分子的表達(dá)。研究表明，miRs與心肌梗死后MF心室重構(gòu)相關(guān)[2-4]。Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29參與了MF過程，過表達(dá)miR-29后，MF過程被抑制，而敲低miR-29后，MF相關(guān)蛋白表達(dá)上升，說明miR-29可抑制MF進(jìn)程。Thum等[6]研究顯示，miR-21可通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路調(diào)控心肌細(xì)胞間質(zhì)纖維化。此外，多種miRs，如：miR-133a[7]、miR-503[8]、miR-101[9]和miR-29[5，10]被證實(shí)能夠影響心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)的生理功能進(jìn)而發(fā)揮抗纖維化作用。miR-133b是與miR-133a同家族的miR，有研究表明miR-133a可抑制心肌纖維化，但是對于miR-133b與心肌纖維化的調(diào)控關(guān)系尚不明確，以往對miR-133b的研究主要集中于腫瘤，在MF過程中的研究鮮有報(bào)道。本研究探索了miR-133b對MF的影響，以期為探尋新型治療和干預(yù)MF的靶分子提供理論依據(jù)。

材料和方法

材料CFs由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。RPMll640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，miR-133b mimic及miR-133b inhibitor均購自廣州銳博公司，X-treme GENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自瑞士羅氏公司，CCK8檢測試劑盒由日本同仁化學(xué)研究所提供，結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、collagenⅠ、collagen Ⅲ、α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)及β-actin抗體購自美國Cell signaling公司。

人CFs細(xì)胞培養(yǎng)采用含100 ml/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，24 h后細(xì)胞融合度達(dá)30%～40%。配制轉(zhuǎn)染試劑混合液：A(每孔)：轉(zhuǎn)染試劑5 μl+無血清無雙抗RPMI 1640 100 μl。B(每孔)：miR-133b mimic(miR-133b inhibitor)或control mimic(control inhibitor)7.5 μl(20 μmol/L)+無血清無雙抗RPMI 1640 100 μl。室溫靜置5 min后混合A、B兩種試劑，室溫靜置20 min為C液。棄去細(xì)胞原培養(yǎng)液，加入C液200 μl及含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基1.3 ml，輕晃混勻后置于37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后提取mRNA，轉(zhuǎn)染72 h后提取蛋白，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

CCK8法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化后離心，細(xì)胞收集后用含100 ml/L胎牛血清的RPMI1640重懸，反復(fù)吹打，制成單細(xì)胞溶液，以每孔1000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21、45、69、93、117 h后，加入10 μl CCK8于每孔細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后測定吸光度值。

Western blot檢測提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，制好膠后，每個(gè)泳道以30μg蛋白上樣，60V恒壓電泳至樣品跑齊成1條直線，90V恒壓電泳至樣品中的溴酚藍(lán)到達(dá)濃縮膠和分離膠的分界線處，將電壓調(diào)至120V繼續(xù)電泳達(dá)到膠底部，轉(zhuǎn)膜完成后將NC膜取出，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白的相對分子質(zhì)量大小將NC膜裁剪成條狀，標(biāo)記后浸泡于封閉液中，室溫下脫色搖床上封閉1 h；將NC膜置于抗體孵育盒中，加入適量相應(yīng)一抗，4℃過夜；TBST洗膜5次，每次8 min；用封閉稀釋液稀釋二抗；將NC膜置于抗體孵育盒中，加入適量相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜8 min×5次。加入發(fā)光試劑ECL曝光。

qRT-PCR提取RNA，采用美國Thermo公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒行進(jìn)RNA反轉(zhuǎn)錄。將引物干粉稀釋成10 μmol/L的工作濃度，以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，按下述體系配制實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)液：SYBY Green 10 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，cDNA模板2.0 μl，ddH2O 7.2 μl；反應(yīng)條件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，72℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)未加模板的陰性對照組，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對表達(dá)量(relative quantity，RQ)，比較每組之間的基因表達(dá)差異。

雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)構(gòu)建含有CTGF mRNA的3’UTR(WT)及其3’UTR突變體(MUT)的雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)。方法是針對CTGF 3’UTR預(yù)測結(jié)合miR-133b區(qū)域，設(shè)計(jì)PCR引物，將PCR產(chǎn)物連在骨架質(zhì)粒pMIR REPORT Luciferase中，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后搖菌，進(jìn)行克隆篩選后送北京華大公司基因測序，結(jié)果經(jīng)比對正確后再搖菌小提得到目的質(zhì)粒。在CFs中共轉(zhuǎn)染miR-133b mimic、WT及pRL-TK(內(nèi)參質(zhì)粒)，轉(zhuǎn)miR-133b mimic control、WT及pRL-TK(內(nèi)參質(zhì)粒)作為對照，24 h后采用檢測試劑盒檢測。對確認(rèn)有效的CTGF 3’UTR區(qū)域，利用重疊PCR原理設(shè)計(jì)引物制造結(jié)合區(qū)域點(diǎn)突變，余過程如上。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本雙側(cè)t檢驗(yàn)；組間構(gòu)成比比較采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-133b mimic及miR-133b inhibitor后miR-133b的表達(dá)變化在CFs轉(zhuǎn)染miR-133b mimic或inhibitor 48 h后提取RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-133b mimic后miR-133b的表達(dá)水平明顯高于陰性對照組(1比1.46×105；t=26.219，P=0.000)，轉(zhuǎn)染miR-133b inhibitor后miR-133b的表達(dá)水平明顯低于陰性對照組(1比0.42；t=6.738，P=0.003)。

miR-133b抑制CFs增殖轉(zhuǎn)染CFs 21、45、69、93和117 h后，與陰性對照組相比，miR-133b mimic組CFs增殖能力明顯降低，而miR-133b inhibitor組CFs增殖水平明顯上升(P均<0.05)(圖1)。

miR-133b對CFs中CTGF、collagenⅠ、collagen Ⅲ和α-SMA的表達(dá)水平影響與陰性對照組相比，過表達(dá)miR-133b后，CTGF(t=9.213，P=0.001；t=8.195，P=0.001)、α-SMA(t=6.511，P=0.003；t=4.434，P=0.011)、collagenⅠ(t=3.172，P=0.034；t=4.053，P=0.015)及collagen Ⅲ(t=6.404，P=0.003；t=5.319，P=0.006)的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)；敲低miR-133b后，CTGF(t=9.439，P=0.001；t=14.100，P=0.000)、α-SMA(t=4.519，P=0.011；t=4.377，P=0.012)、collagenⅠ(t=5.966，P=0.004；t=5.514，P=0.005)及collagen Ⅲ(t=4.622，P=0.010；t=4.996，P=0.008)的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯上升(圖2)。

CTGF為miR-133b的靶基因?qū)iR-133b mimic或mimic control與WT 3’UTR表達(dá)載體或MUT 3’UTR表達(dá)載體以及海腎熒光素酶表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染CFs，檢測并比較不同實(shí)驗(yàn)組熒光素酶的相對活性，結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-133b mimic和WT 3’UTR表達(dá)載體細(xì)胞的相對熒光素酶活性明顯低于共轉(zhuǎn)染mimic control和WT 3’UTR表達(dá)載體的細(xì)胞(t=5.654，P=0.005)，共轉(zhuǎn)染miR-133b mimic和MUT 3’UTR表達(dá)載體細(xì)胞的相對熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染mimic control和MUT 3’UTR表達(dá)載體的細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.380，P=0.724)(圖3)。

CFs：心肌成纖維細(xì)胞
CFs：cardiac fibroblasts
A.過表達(dá)miR-133b抑制CFs增殖；B.敲低miR-133b促進(jìn)CFs增殖
A.miR-133b overexpression inhibited proliferation of CFs；B knockdown of miR-133b promoted proliferation of CFs
圖1miR-133b對CFs增殖的影響
Fig1Effect of miR-133b on the proliferation of CFs

CTGF：結(jié)締組織生長因子；α-SMA：α平滑肌肌動蛋白
CTGF：connective tissue growth factor；α-SMA：α-smooth muscle actin
A.mRNA水平；B.蛋白水平
A.mRNA level；B.protein level
圖2miR-133b對纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響
Fig2Effect of miR-133b on fibrosis-related indicators

討 論

MF是心肌組織重構(gòu)的表現(xiàn)之一，是由反復(fù)或持續(xù)性心肌缺血導(dǎo)致的。因此，許多心血管疾病，如心肌梗死、心力衰竭等的基礎(chǔ)病變之一即為MF。深入了解心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制，明確其進(jìn)程中的關(guān)鍵分子可能為抑制MF，逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)的精準(zhǔn)治療提供新的靶點(diǎn)。CFs是纖維化時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)重要的來源細(xì)胞，當(dāng)CFs被激活增殖，細(xì)胞外基質(zhì)合成分泌增加，進(jìn)一步促進(jìn)了纖維化。因此，抑制CFs活化增殖是抑制MF的關(guān)鍵點(diǎn)[11]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-133b可以抑制CFs增殖，提示miR-133b可能參與了MF的過程。

CTGF又名CNN2，是基質(zhì)細(xì)胞蛋白家族成員，由349個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為34 000～38 000，是一種富含半胱氨酸的分泌肽。在正常心肌組織中，CTGF主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞；在多種誘因所致的心肌纖維化中，CTGF在成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[5]。在心肌組織受損后出現(xiàn)，許多平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物在心肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)升高，如α-SMA，其聚集于應(yīng)力纖維可以通過細(xì)胞表面特殊的黏附因子改變細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)[3]。Ⅰ、Ⅲ型膠原是構(gòu)成心肌膠原網(wǎng)絡(luò)的主要成分，膠原纖維的數(shù)量、分布及排列發(fā)生改變均可導(dǎo)致纖維化的發(fā)生，是心肌纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-133b可以抑制CFs中的CTGF、collagenⅠ、collagen Ⅲ和α-SMA水平，而抑制miR-133b可以增加CFs中的CTGF、collagenⅠ、collagen Ⅲ和α-SMA水平，提示miR-133b可抑制心肌纖維化過程。

WT：野生型CTGF3’UTR表達(dá)載體；MUT：突變型CTGF 3’UTR表達(dá)載體
WT：wild-type CTGF 3’UTR expression vector；MUT：mutant CTGF 3’UTR expression vector
圖3miR-133b靶向抑制CTGF
Fig3miR-133b targeted CTGF

研究顯示，CTGF作為轉(zhuǎn)化生長因子β下游分子在MF中起重要作用，發(fā)生MF時(shí)，CTGF的表達(dá)水平明顯上調(diào)。本研究采用生物學(xué)軟件分析CTGF的3’UTR區(qū)存在miR-133b結(jié)合的“種子區(qū)域”，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTGF為miR-133b的靶基因，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了miR-133b可靶向抑制CTGF的表達(dá)。

綜上，本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-133b可抑制CFs增殖，并下調(diào)纖維化指標(biāo)CTGF、α-SMA、collagenⅠ、collagen Ⅲ的mRNA及蛋白表達(dá)水平，反之亦然，且CTGF為miR-133b的靶基因。提示miR-133b可能是通過靶向抑制CTGF來影響CFs的活化增殖，從而改善心肌纖維化。