王 鵬，李芳弟，郭天順，竇俊煥，頡煒清，羅照霞，齊小東，楊 晨，趙中梁，宋 怡，呂 汰

（甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，甘肅 天水 741001）

隨著馬鈴薯主糧化發(fā)展和加工業(yè)企業(yè)興起的需要，育成的品種除具備抗病、高產(chǎn)特性外，還需適宜食品加工（炸片、炸條、淀粉、全粉）和鮮薯出口。甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所由于馬鈴薯種質(zhì)資源保存與利用滯后，育種缺乏優(yōu)質(zhì)親本，現(xiàn)已育成品種主要以甘肅省平?jīng)鍪星f浪縣農(nóng)機(jī)推廣中心育成的品種‘莊薯3 號’和甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所自育品系‘天99-5-4’為親本。

種質(zhì)的價(jià)值決定于種質(zhì)自身的遺傳多樣性、可利用性和有效性[1]。在育種實(shí)踐中，環(huán)境及人為因素的影響使得選擇過程操作起來較為困難，而利用DNA指紋差異則可直接提供與目標(biāo)性狀有關(guān)的DNA水平信息，避免了環(huán)境干擾，從而大大提高了雜交育種對親本及后代理想單株的選擇效率[2]。國外分子標(biāo)記技術(shù)用于馬鈴薯遺傳多樣性研究較早[3-6]。近年來，Gavrilenko等[7]利用SSR標(biāo)記技術(shù)對237份具有栽培馬鈴薯特性的種質(zhì)和155份具有野生種特性并接近栽培種種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行分析，并分析其與野生種的遺傳關(guān)系，結(jié)果表明，所有的材料聚為A、B 兩大類，A 類包括了具有二倍體、三倍體和四倍體的栽培種和部分具有野生型親本的種質(zhì)，B類包括大部分的野生型種質(zhì)和雜交栽培種。國內(nèi)分子標(biāo)記技術(shù)用于馬鈴薯遺傳多樣性研究相比國外較晚[8-14]。Wang Fang 等[15]利用AFLP 分子標(biāo)記技術(shù)對123份引自國際馬鈴薯中心（CIP）及部分國內(nèi)育成馬鈴薯品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，CIP引進(jìn)馬鈴薯種質(zhì)遺傳多樣性豐富，中國馬鈴薯品種遺傳相似度較高，遺傳基礎(chǔ)狹窄，可以利用CIP資源來拓寬中國馬鈴薯狹窄的遺傳基礎(chǔ)。

為了擴(kuò)大馬鈴薯種質(zhì)資源基因庫，迎合中國馬鈴薯主食化發(fā)展及對主食化品種的需求，甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所近兩年收集并引進(jìn)不同基因型的馬鈴薯資源。為進(jìn)一步將這些資源材料用于馬鈴薯育種親本的選配中，本研究利用引進(jìn)的國內(nèi)育成馬鈴薯品種以及甘肅省主要育成的部分馬鈴薯品種，用SSR分子標(biāo)記檢測方法對其遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，明確甘肅省部分馬鈴薯栽培品種與引進(jìn)馬鈴薯品種的遺傳多樣性，為拓寬甘肅省馬鈴薯育成品種遺傳基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 參試材料

馬鈴薯品種共計(jì)65個(gè)（表1），包括甘肅省育成品種14個(gè)，引進(jìn)馬鈴薯品種47個(gè)，甘肅省天水市地方品種4個(gè)。

1.2 馬鈴薯基因組DNA的提取

摘取馬鈴薯田間幼嫩葉片，利用改良的CTAB法[16]提取馬鈴薯基因組DNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的質(zhì)量和完整性。

1.3 SSR引物篩選

采用輪篩法篩選多態(tài)性較好的引物，第1輪隨機(jī)選取‘天薯11號’和‘中薯18號’，SSR引物來自于公開發(fā)表的文獻(xiàn)[6,17,18]，從100對引物中篩選出在兩份材料間有條帶的引物；第2輪以5份材料（‘天薯10號’、‘隴薯7號’、‘中薯10號’、‘云薯506’、‘麗薯10號’）進(jìn)一步篩選出多態(tài)性指數(shù)較高的引物，引物多態(tài)性指數(shù)PPB（Percentage of polymorphic bands）：PPB（%）=（K/N）×100，（其中K 為擴(kuò)增多態(tài)性條帶數(shù)，N為擴(kuò)增條帶總數(shù)）。用篩選出的多態(tài)性指數(shù)較高的SSR引物對供試馬鈴薯品種進(jìn)行擴(kuò)增分析。

表1 供試材料名稱及來源Table 1 Names and sources of materials

續(xù)表1Continued Table 1

1.4 PCR擴(kuò)增和電泳檢測

1.4.1 PCR擴(kuò)增體系

PCR 反 應(yīng)在Eppendorf Master-cycler PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行。SSR反應(yīng)體系和程序按照Ghislain等[6]的方法，SSR-PCR體系（10 μL）：2×Taq PCR Master Mix（中科瑞泰生物科技有限公司）5 L，10 ng/μL上游引物和下游引物各1 μL，100 ng/μL 模板DNA 1 μL，ddH2O 2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，復(fù)性（以引物最適退火溫度而定）50 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4.2 PAGE凝膠電泳檢測

采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳（恒功率70 W 電泳1.5 h）。凝膠染色步驟：ddH2O 漂洗2～3 min，2 g/L 硝酸銀染色15 min，蒸餾水漂洗30 s，20 g/L氫氧化鈉中加入37%甲醛4 mL顯色至條帶清晰可見，蒸餾水漂洗，照相。

1.5 SSR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對擴(kuò)增后清晰、穩(wěn)定、易讀的條帶采用‘0-1’系統(tǒng)記錄其位置，在相同的遷移位置上有帶記‘1’，無帶記‘0’，構(gòu)建‘0,1’二元數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc 2.1遺傳多樣性分析軟件計(jì)算供試材料之間的遺傳相似系數(shù)，按照UPGMA（Un-weighted pair group method using arithmetic averages）方法進(jìn)行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR多態(tài)性引物篩選

篩選出25對多態(tài)性指數(shù)較高的馬鈴薯SSR引物（表2）。

2.2 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

利用篩選出的25 對多態(tài)性指數(shù)較高的SSR 引物，對65 份馬鈴薯品種進(jìn)行SSR 擴(kuò)增分析。擴(kuò)增結(jié)果顯示，25 對引物共檢測出145 個(gè)清晰、穩(wěn)定、易讀的條帶，引物擴(kuò)增條帶數(shù)為3～12 個(gè)，平均每對引物擴(kuò)增出5.88 個(gè)條帶，其中，多態(tài)性條帶145 個(gè)，平均多態(tài)性比率為100%。引物STI005擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多（12個(gè)），擴(kuò)增條帶數(shù)最少的為引 物STM1104、STGBSS、SSR594、STM1106 和STI052，條帶總數(shù)均為3 個(gè)（表2）。圖1 為引物STI052對部分馬鈴薯基因型的擴(kuò)增結(jié)果。

表2 馬鈴薯品種SSR分析的多態(tài)性引物序列Table 2 Polymorphic primer sequences of potato variety SSR analysis

圖1 引物STI052對部分馬鈴薯品種的SSR擴(kuò)增Figure 1 SSR amplification of some potato varieties by Primer STI052

2.3 供試馬鈴薯品種的親緣關(guān)系

用NTSYS-pc 2.1數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算了65份供試馬鈴薯品種兩兩之間的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity,GS）在0.60～0.93，平均遺傳相似系數(shù)為0.76?；谶z傳相似系數(shù)用類平均法（UPGMA）對供試材料進(jìn)行聚類，結(jié)果表明（圖2），在GS 為0.60時(shí)，供試材料分為兩大類，‘華恩1 號’單獨(dú)聚為一類，該品種為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、湖北恩施中國南方馬鈴薯研究中心從雜交組合‘395049’的子代實(shí)生系中選擇優(yōu)良單株經(jīng)無性繁殖而成的品種。其余64 份材料聚為第二類；在GS 為0.61 時(shí)，第二類又分為兩個(gè)亞類，‘農(nóng)天1 號’、‘甘谷紫’、‘天薯9 號’、‘五龍洋芋’、‘天薯10 號’聚為第一亞類；其余59份材料聚為第二亞類；‘農(nóng)天1號’、‘天薯9號’和‘天薯10號’為甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所先后選育的品種，‘農(nóng)天1號’和‘天薯10號’共同親本是‘莊薯3號’，其中，‘甘谷紫’和‘五龍洋芋’均為天水地方品種。在GS為0.64時(shí)，第二亞類又分為2個(gè)亞亞類：第1亞亞類為‘天薯11號’、‘青薯10號’、‘青薯6號’、‘甘谷紅’和‘秦州紅’，其中，青海省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所育成的‘青薯10號’和‘青薯6 號’相似系數(shù)最高，達(dá)0.93，搜集于甘肅省天水市不同的兩個(gè)縣區(qū)的地方品種‘甘谷紅’和‘秦州紅’相似系數(shù)較高，達(dá)0.88，其外觀（薯型、薯皮、芽眼等）有一定的相似性，其余54 份材料聚為第2 亞亞類：在GS為0.65時(shí)，‘延薯系列（延薯4、7、8、9、10）’、‘鄂馬鈴薯11號’和‘米拉’7份材料被聚為一組，在GS為0.66時(shí)，‘隴薯13號’和‘夏波蒂’，‘紅玫瑰’、‘希森6號’、‘克新22號’和‘蘇蘭1號’分別聚在一起，其余41 份材料（占供試材料的63.08%）：在GS 為0.67 時(shí)，‘中薯7 號’、‘虎頭’、‘中薯18號’、‘大西洋’、‘早大白’、‘鄂薯5號’、‘麗薯6號’、‘云薯605’、‘宣薯5號’、‘中薯19號’、‘川涼薯7號’、‘畢薯2號’和‘克新6號’13份材料聚在一起，在GS為0.68時(shí)，‘青薯2號’、‘冀張薯14號’、‘冀張薯8號’、‘云薯201’、‘蒙薯17號’、‘蒙薯10號’、‘中薯3號’、‘鄭薯7號’、‘農(nóng)天2號’、‘中薯10號’、‘中薯11號’、‘天薯13號’、‘青薯9號’、‘希森5號’、‘希森3號’、‘隴薯12號’、‘費(fèi)烏瑞它’、‘冀張薯12號’和‘隴薯6號’19份材料聚為一組，在GS為0.70時(shí)，‘隴薯8號’、‘隴薯7號’、‘莊薯4號’、‘肯德’、‘天薯12號’、‘中薯8號’、‘隴薯10號’、‘青薯7號’和‘訥薯16號’9份材料聚在一起。來自于美國的薯片加工型品種‘大西洋’、來自于德國的中晚熟品種‘米拉’、來自于加拿大的薯?xiàng)l加工型品種‘夏波蒂’與國內(nèi)育成品種的遺傳差異并不十分明顯，這可能是由于這些品種被引進(jìn)國內(nèi)后，將其作為親本反復(fù)利用，與國內(nèi)育成品種做過很多雜交，因此，育成品種中有其血緣，遺傳關(guān)系較近，遺傳差異較小。

圖2 供試馬鈴薯品種的聚類Figure 2 Cluster analysis of tested potato varieties

就供試馬鈴薯品種的遺傳距離（Genetic distance，GD）來看，樂陵希森馬鈴薯產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司育成的早熟馬鈴薯品種‘希森3號’與甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所育成的晚熟淀粉加工型品種（淀粉含量達(dá)19.44%）‘天薯10 號’、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)與天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所合作育成的鮮食菜用型馬鈴薯品種‘農(nóng)天1號’遺傳距離最大（GD=1.000 0），‘希森3號’與‘天薯9號’差異也較大；‘天薯10 號’與‘紅玫瑰’、‘希森3 號’與‘五龍洋芋’親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳距離最大，均為0.922 4，‘農(nóng)天1號’與早熟品種‘費(fèi)烏瑞它’（GD=0.862 5）、‘紅玫瑰’、‘延薯4號’、‘云薯605’遺傳差異均較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；‘天薯10 號’與‘延薯10 號’（GD=0.853 7）、‘肯德’、‘夏波蒂’的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，遺傳距離均大于0.800 0，其次，‘天薯10號’與‘米拉’、‘延薯9號’、‘蒙薯10號’、‘隴薯12號’、‘中薯7號’、‘中薯19號’、‘蘇蘭1號’、‘希森5號’、‘中薯3號’、‘云薯605’遺傳差異也較大，‘天薯10號’和‘農(nóng)天1號’是當(dāng)?shù)赜N單位重要的育種親本，在馬鈴薯雜交育種中，可以利用‘天薯10號’、‘農(nóng)天1號’與上述遺傳差異較大的品種進(jìn)行雜交選配工作，進(jìn)而為選育出綜合性狀優(yōu)異的馬鈴薯新品種奠定基礎(chǔ)。部分供試馬鈴薯品種的遺傳距離見表3。

3 討 論

馬鈴薯品種來源、遺傳距離和遺傳背景差異較大的在聚類圖（圖2）中被分離出聚為一類，如‘華恩1號’、‘天薯11號’、‘鄂馬鈴薯11號’等。來源相同或同一育種單位的育成品種，遺傳差異較小、距離較近，如甘肅天水地方品種和育成品種‘農(nóng)天1號’、‘天薯9號’、‘天薯10號’、‘甘谷紫’和‘五龍洋芋’聚在一起，‘延薯4號’、‘延薯7號’、‘延薯8號’、‘延薯9號’和‘延薯10號’聚在一起，‘青薯10號’和‘青薯6 號’、‘青薯7 號’和‘訥薯16 號’、‘中薯10號’和‘中薯11 號’、‘蒙薯10 號’和‘蒙薯17 號’、‘冀張薯8號’和‘冀張薯12號’分別聚在一起。這可能由于相同栽培區(qū)域和各育種單位集中化利用親本，所以同一個(gè)育種單位培育的品種大多聚在相同類群中，該結(jié)果與時(shí)啟冬等[19]和段艷鳳等[20]的研究結(jié)果一致。比如，‘延薯9號’是吉林省延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院以‘延薯8 號’為母本、‘早大白’為父本育成的中晚熟品種，‘延薯7號’是以‘延薯4號’為母本、‘早大白’為父本，有性雜交獲得實(shí)生籽，經(jīng)過各世代鑒定篩選而育成。所以都聚在一起，由此也證明了SSR分子標(biāo)記方法在作物品種血緣關(guān)系分析中的準(zhǔn)確性與可靠性。

在本研究中有些聚類分析結(jié)果與實(shí)際的親緣關(guān)系不太符合，如‘青薯10號’和‘青薯6號’在本研究中相似系數(shù)較高，兩個(gè)品種均為青海省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所先后選育而成，‘青薯10號’是從國際馬鈴 薯 中 心（CIP）引 進(jìn) 雜 交 組 合（‘387521.3’בAphrodite’）材料‘C92.140-05’中選出優(yōu)良單株ZT，后經(jīng)系統(tǒng)選育而成，而‘青薯6號’親本為‘固33-1’和‘92-9-44’（‘73-21-1’בDesiree’），兩個(gè)品種沒有共同的親本，此結(jié)果的產(chǎn)生可能與研究中所選的SSR引物及其數(shù)量有關(guān)，擴(kuò)增獲得的多態(tài)性條帶有限，不能充分表現(xiàn)出材料之間真實(shí)的遺傳關(guān)系。

也有不同來源的品種相似性較高，如‘大西洋’和‘中薯18號’、‘費(fèi)烏瑞它’和‘冀張薯12號’、‘中薯3號’和‘鄭薯7號’、‘隴薯7號’和‘莊薯4號’等，‘中薯18 號’是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所用‘C91.628’בC93.154’選育的品種，‘大西洋’親本為‘B5141-6’（Lenape）בWauseon’，是1978 年由農(nóng)業(yè)部和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院引入中國，這很可能是不同育種單位間相互引種，共用親本，使得這些品種具有共同的血緣，遺傳差異較小。但是，部分血緣關(guān)系較近的品種相似性卻不高，比如，早熟品種‘鄭薯7 號’為河南省鄭州市蔬菜研究所利用‘費(fèi)烏瑞它’為母本、‘豫馬鈴薯1號’為父本育成，炸片加工型品種‘大西洋’為‘冀張薯12號’的母本，可是，

在本研究中，‘鄭薯7號’與其母本早熟品種‘費(fèi)烏瑞它’、‘冀張薯12號’與‘大西洋’卻相聚較遠(yuǎn)，這可能是雜交后代中群體分離比較大，使其與親本間發(fā)生了較大的遺傳差異。

表3 部分供試馬鈴薯品種的遺傳距離Table 3 Genetic distance of some potato varieties

馬鈴薯在中國屬于外來作物，因此，馬鈴薯種質(zhì)資源十分有限，本研究通過對甘肅省主要育成馬鈴薯品種和引進(jìn)品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)部分引進(jìn)主食化馬鈴薯品種與甘肅省育成品種遺傳差異較大，是較好的親本資源，應(yīng)加大其今后在馬鈴薯育種中的應(yīng)用。