(河北省秦皇島市第一醫(yī)院，河北 秦皇島 066000)

目前，胃癌發(fā)病率位列最常見惡性腫瘤第四位，而死亡率卻在惡性腫瘤中位列第二位[1]。1994年，世界衛(wèi)生組織通過臨床及流行病學(xué)資料研究將幽門螺桿菌(Hp)列為第一類致癌因子[2]。Hp菌株最常見的毒力因子類型是cagA基因[3]。研究證實幽門螺桿菌cagA基因可分為2種類型，一種為存在于大部分亞洲Hp菌株中，為東亞型；另一種主要存在于美國和歐洲Hp菌株中，為西方型。并且以上兩種菌株堿基序列完全不同[4-5]。Hp cagA基因多態(tài)性可導(dǎo)致不同的臨床結(jié)局。目前國內(nèi)外關(guān)于患者胃組織中Hp感染誘導(dǎo)IL-22高表達的研究僅見少量報道，Roussel Y等[6]通過RT-PCR和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，Hp感染患者胃組織中IL-22 呈異常高表達，但cagA基因多態(tài)性與胃癌細胞IL-22表達的關(guān)系目前尚未見報道。本試驗采用RT-PCR法檢測胃癌細胞IL-22 mRNA 相對表達量進行上述相關(guān)研究。

1 實驗材料與方法

1.1實驗耗材 ①菌株：AGS細胞、SGC7901細胞購自于中國科學(xué)院上海細胞所。HPK5菌株、HP26695菌株、HPK5CA菌株、HP26695CA菌株購自美國ATCC公司。②主要試劑：人白細胞介素-22(IL-22)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(南京奧尼多福公司， 型號:YB-E10105)， PrimeScript RT Enyme Mix 1 (寶生物工程(大連)有限公司，型號：DRR047A)。③儀器：酶標分析儀450nm(美國BIO-RAD，型號：680.iMark)，BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司 型號：Gel Doc XR+and White Light Conversion Screen1708195+1708289)。

1.2試驗方法與步驟

1.2.1幽門螺桿菌分別感染AGS細胞、SGC7901細胞 幽門螺桿菌cagA基因東亞型HP5K菌株、西方型HP26695菌株處于對數(shù)生長期時，分別清洗2遍，離心機5000 r/min離心5 min；用1640培養(yǎng)基原液分別制備幽門螺桿菌懸液。細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底的80%時，棄掉原培養(yǎng)基，按細菌∶細胞=150∶1比例加入幽門螺桿菌懸液，放入37℃、5% 孵育箱共同培養(yǎng)0.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h及24 h。

1.2.2Trizol法提取IL-22mRNA 在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。

1.2.2.1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑組分 該體系的各種試制組分體積量見表1。

表1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑組分

1.2.2.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程 將上述反應(yīng)體系放置37℃水浴中，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min，加熱至85℃持續(xù)5 s，然后冷卻至4℃，將cDNA保存于-20℃冰箱。

1.2.2.3PCR反應(yīng)引物合成 IL-22基因序列所需引物由上海生物工程公司設(shè)計合成。IL-22：上游引物5’CAGAAGGCCAACTTCAAG3’；下游引物5’GGTGGCTCAGACTGACTG3’。β-actin：上游引物5’TTCCTTCCTGGGCATGGAGTCC3’；下游引物5’TGGCGTACAGGTCTTTGCGG3’。

1.2.2.4配置PCR反應(yīng)體系 配置該反應(yīng)體系所需的各種試劑體積量，見表2。

表2 PCR反應(yīng)體系的各種試劑量

1.2.2.5IL-22 RT-PCR反應(yīng)條件及過程 將上述反應(yīng)體系放置95 ℃水浴中預(yù)變性5 min，95 ℃變性50 s，48 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s(變性、退火、延伸進行40個循環(huán))，72 ℃終止延伸5 min，放置-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.2.3ELISA檢測IL-22濃度 采用ELISA試劑盒檢測IL-22濃度。AGS細胞分別與Hp cagA基因東亞型HPK5菌株和西方型HP26695菌株共培養(yǎng)0.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h后(按MOI=150∶1比例感染)，取出上述不同時間段的AGS細胞，3000 r/min離心機上離心20 min。收集細胞上清，ELISA檢測IL-22濃度表達水平。將標準品倍比稀釋后加入酶標板孔中，分別設(shè)空白孔和待測樣品孔。經(jīng)過稀釋-封板-酶標-再封板，反復(fù)5次，用酶標儀在450 nm測定OD值；將空白孔設(shè)為對照，以O(shè)D值為縱坐標，濃度為橫坐標，做出標準曲線并求出曲線方程，然后根據(jù)待測樣品的OD值在該曲線上求出相應(yīng)的IL-22濃度，再乘以稀釋倍數(shù)5倍，即待測樣品的濃度。SGC7901細胞操作同上。

2 實驗結(jié)果

2.1RT-PCR檢測IL-22 mRNA的表達

2.1.1Hp感染AGS細胞后的IL-22m RNA表達量 2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物均清晰可見兩條條帶，上方為β-actin，下方為目的基因。HPK5感染AGS細胞RT-PCR結(jié)果(見圖1)， HP26695感染AGS細胞RT-PCR結(jié)果(見圖2)。

通過BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)自帶的Quantity One 1-D分析軟件分別測出HPK5菌株感染組和HP26695菌株感染組0.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h的IL-22 mRNA和β-actin擴增條帶的OD值，以目的基因和β-actin擴增條帶強度的比值來分析IL-22 mRNA相對表達量。上述不同時間段HPK5菌株感染AGS細胞所誘導(dǎo)IL-22 mRNA的相對表達量均高于HP26695菌株感染AGS細胞所誘導(dǎo)IL-22 mRNA的相對表達量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表3)，結(jié)果提示HPK5菌株誘導(dǎo)AGS細胞產(chǎn)生IL-22 mRNA的表達量大。分析cagA基因東亞型HPK5菌株和西方型HP26695菌株誘導(dǎo)IL-22 mRNA表達模式，通過LSD-t檢驗進行同一菌株不同時間段間IL-22 mRNA相對表達量兩兩比較得出，HPK5菌株感染AGS細胞0.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h間的IL-22 mRNA相對表達量均有差異(P<0.05)。HP26695菌株感染AGS細胞6h與9h間IL-22 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，0.5 h、3 h、12 h、24 h間的IL-22 mRNA相對表達量均有差異(P<0.05)(見表3)。結(jié)果提示HPK5菌株感染AGS細胞誘導(dǎo)IL-22 mRNA相對表達量呈時間依賴性，HP26695菌株感染AGS細胞誘導(dǎo)IL-22 mRNA相對表達量在3 h、12 h時出現(xiàn)峰值。

2.1.2Hp感染SGC7901細胞后的IL-22 mRNA表達量 2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物均清晰可見兩條條帶，上方為β-actin，下方為目的基因。HPK5感染SGC7901細胞RT-PCR結(jié)果(見圖3)， HP26695感染SGC7901細胞RT-PCR結(jié)果(見圖4)。

HPK5菌株和HP26695菌株感染SGC7901細胞0.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h間的IL-22 mRNA相對表達量均有差異(P<0.05)(見表4)，上述不同時間段HPK5菌株感染SGC7901細胞所誘導(dǎo)IL-22 mRNA的相對表達量高于HP26695菌株感染SGC7901細胞所誘導(dǎo)IL-22 mRNA的相對表達量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表4)，結(jié)果提示HPK5菌株誘導(dǎo)SGC7901細胞產(chǎn)生IL-22 mRNA的表達量大。結(jié)果顯示HPK5菌株和HP26695菌株感染SGC7901細胞誘導(dǎo)IL-22 mRNA相對表達量均隨時間的增加而增加。

表3 Hp感染AGS細胞不同時間段IL-22 mRNA相對表達量的比較

注：與HP26695感染組相比，a：P<0.05

表4 Hp感染SGC7901細胞不同時間段IL-22 mRNA相對表達量的比較

注：與HP26695感染組相比，a：P<0.05

圖1 HPK5感染AGS細胞RT-PCR結(jié)果 圖2 HP26695感染AGS細胞RT-PCR結(jié)果 圖3 HPK5感染AGS細胞RT-PCR結(jié)果 圖4 HP26695感染AGS細胞RT-PCR結(jié)果

2.2ELISA檢測IL-22濃度 0.5 h時cagA基因東亞型HPK5菌株和西方型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導(dǎo)IL-22濃度的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；3 h、6 h、9 h、12 h、24 h時cagA基因東亞型HPK5菌株和西方型HP26695菌株感染AGS細胞所誘導(dǎo)IL-22濃度不同，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。0.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h時cagA基因東亞型HPK5菌株和西方型HP26695菌株感染SGC7901細胞所誘導(dǎo)IL-22濃度的比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表6。結(jié)果提示HPK5菌株誘導(dǎo)AGS細胞、SGC7901細胞產(chǎn)生IL-22濃度大。

通過LSD-t檢驗進行同一菌株不同時間段IL-22濃度兩兩比較得出，HPK5菌株感染AGS細胞0.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h間的IL-22濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HP26695菌株感染AGS細胞6 h與9 h間IL-22濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，0.5 h、3 h、12 h、24 h間的IL-22濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示HPK5菌株感染AGS細胞誘導(dǎo)IL-22濃度呈時間依賴性，HP26695菌株感染AGS細胞誘導(dǎo)IL-22濃度在3 h、12 h時出現(xiàn)峰值。HPK5菌株和HP26695菌株感染SGC7901細胞0.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h間的IL-22濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示HPK5菌株和HP26695菌株感染SGC7901細胞誘導(dǎo)IL-22濃度均隨時間的增加而增加。

表5 Hp感染AGS細胞各時間段IL-22 濃度的比較

注：與HP26695感染組相比，a：P<0.05

表6 Hp感染SGC7901細胞各時間段IL-22 濃度的比較

注：與HP26695感染組相比，a：P<0.05

3 討論

胃癌是全球腫瘤最常見的死亡原因之一[7]，且預(yù)后不容樂觀。最近已報道CD4(+)IL-22(+)T細胞分泌細胞因子IL-22。研究發(fā)現(xiàn)，在患者的腫瘤-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移推進階段，腫瘤內(nèi)IL-22(+)CD4(+)T細胞和Th22細胞百分比較高，從而預(yù)測其降低了患者整體生存率[8-9]。總之，IL-22(+)CD4(+)T細胞和Th22細胞在胃癌微環(huán)境中十分重要，腫瘤內(nèi)IL-22(+)CD4(+)T細胞和Th22細胞增加與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切，這表明浸潤腫瘤的IL-22(+)CD4(+)T細胞和Th22細胞是胃癌患者合適的治療靶點[10]。研究證實，IL-22在胃癌組織中起到促進作用，但幽門螺桿菌cagA基因多態(tài)性對IL-22表達的作用未闡述。

幽門螺桿菌是一種彎曲、多鞭毛、微需氧的革蘭氏陰性桿菌，大小約2.5～4.0 μm。其在胃黏膜及胃黏膜下層持續(xù)存在，與慢性胃炎、胃潰瘍、胃腫瘤和胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等多種疾病相關(guān)密切[11-12]。cagA作為幽門螺桿菌重要的毒力因子在誘導(dǎo)疾病過程中的作用是不可缺少的。cagA基因多態(tài)性對臨床結(jié)局有較顯著的影響，不同基因分型的cagA菌株可能導(dǎo)致不同的臨床結(jié)局。

本實驗通過cagA基因東亞型HPK5菌株和西方型HP26695菌株感染AGS細胞及SGC7901細胞發(fā)現(xiàn)，東亞型HPK5菌株誘導(dǎo)AGS細胞、SGC7901細胞IL-22 mRNA表達水平及IL-22濃度表達水平均高于西方型HP26695菌株，IL-22作為炎性因子加重胃腸的炎癥反應(yīng)，故IL-22表達量越高，對組織產(chǎn)生的損害越嚴重。本實驗的結(jié)果與上述觀點相符合。分析cagA基因加重胃腸道炎癥及癌變的可能機制如下：胃上皮細胞是Hp直接接觸的細胞，游離的cagA通過T4SS途徑轉(zhuǎn)運至胃癌上皮細胞[13]。cagA進入胃上皮組織細胞后，與Src、FAK形成有活性的復(fù)合物，使cagA發(fā)生磷酸化。且T4SS途徑是由cagA的易位和磷酸化所觸發(fā)。磷酸化的cagA主要功能在EPYIA序列，EPYIA-A或EPYIA-C片段的數(shù)量越多就越易發(fā)生磷酸化，與Src酪氨酸磷酸酶結(jié)合就越多，使細胞產(chǎn)生蜂鳥型變。EPYIA-A或EPYIA-C片段存在于東亞型菌株中，因此感染東亞型菌株的人得更容易發(fā)展為胃癌。磷酸化的cagA通過激活C末端的Src酪氨酸磷酸酶使細胞骨架拉長，從而導(dǎo)致胃上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細胞邊緣出現(xiàn)多個足突，呈現(xiàn)蜂鳥型細胞[14]。穩(wěn)定的cagA-Src酪氨酸磷酸酶的復(fù)合體對于胃癌的發(fā)生發(fā)展有著至關(guān)重要的作用。磷酸化后的cagA誘導(dǎo)信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致上皮細胞炎癥損傷。cagA基因可破壞P53細胞凋亡刺激蛋白的功能。當cagA注入宿主細胞后與P53細胞凋亡刺激蛋白的結(jié)合，兩者相互作用后，抑制細胞凋亡[15]。

關(guān)于IL-22與胃相關(guān)疾病的關(guān)系及作用機制有待進一步探討。本實驗結(jié)果顯示cagA基因是誘導(dǎo)細胞IL-22 mRNA表達的重要因子，cagA基因東亞型菌株更易誘導(dǎo)IL-22 mRNA及濃度的表達，且cagA基因不同亞型誘導(dǎo)IL-22 mRNA表達的模式不同。若幽門螺桿菌cagA基因感染胃癌AGS細胞，在根除幽門螺桿菌的同時，采用適當?shù)慕档突蛞种艻L-22 mRNA表達的措施，可很好地緩解幽門螺桿菌感染的臨床癥狀，亦可為臨床藥物療效評估、幽門螺桿菌根治提供理論依據(jù)。