郭莉群1，程藝，袁銀莉3，孔祥

(1.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002；2. 皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院/弋磯山醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽 蕪湖 241001；3. 皖南醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

隨著生活方式的改變，中國肥胖人群的數(shù)量不斷攀升，已構(gòu)成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1]。肥胖的重要特征是存在代謝性炎癥，即代謝失調(diào)所致產(chǎn)物，如游離脂肪酸、脂多糖等所觸發(fā)的慢性、低程度炎癥反應(yīng)[2-3]。代謝性炎癥是肥胖誘發(fā)胰島素抵抗的重要原因，并與2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]。炎癥小體(inflammasome)是近年來發(fā)現(xiàn)的，由模式識(shí)別受體參與組裝的多蛋白質(zhì)復(fù)合體，其作用的闡明有助于更深入的了解代謝性炎癥的分子機(jī)制[5-6]。目前發(fā)現(xiàn)的炎癥小體主要包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、IPAF和AIM2，其中NLRP3炎癥小體被證實(shí)在2型糖尿病等代謝性疾病的進(jìn)展中起著關(guān)鍵的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建并篩選最佳的NLRP3腺病毒干擾載體，為進(jìn)一步研究NLRP3基因的作用及機(jī)制提供有效的工具。

1 資料與方法

1.1主要菌株和試劑 pHBAd-U6-CMV(漢恒生物科技公司)；大腸桿菌菌株DH5α、Trizol Reagent(美國英杰生命技術(shù)有限公司)；限制性內(nèi)切酶和T4連接酶(賽默飛世爾科技公司)；質(zhì)粒DNA抽提試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技公司)；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基及特級(jí)澳洲胎牛血清(美國吉布克生物科技公司)；Real time-PCR 試劑盒、SYBR@染色法熒光定量試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡生物科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Ad-NLRP3-shRNA的構(gòu)建 針對(duì)小鼠NLRP3基因，設(shè)計(jì)、合成3對(duì)NLRP3短發(fā)卡RNA(shorthairpin RNA，shRNA)干擾序列(見表1)，由上海桑尼生物合成PAGE膠純化的oligo序列，稀釋至100 μM備用。用BamHI，EcoRI雙酶切載體，酶切完成后回收膠。利用3’和5’的單鏈退火獲得目的片斷shRNA，將處理好的目的片段shRNA與pHBAd-U6-CMV載體連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，平板挑菌，37℃ 250 r/min搖菌14 h，收取NLRP3-shRNA菌液送上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 NLRP3 shRNA干擾序列

1.2.2Ad-NLRP3-shRNA包裝、收毒、擴(kuò)增及滴度測(cè)定 取2μg NLRP3 shRNA重組腺病毒載體質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG 4 μg轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(HEK293)， 培養(yǎng)6 h后換新鮮培養(yǎng)基。每天仔細(xì)觀察細(xì)胞是否有變大、變圓，呈葡萄狀且有明顯噬斑的出毒現(xiàn)象，待大部分細(xì)胞出現(xiàn)該現(xiàn)象并脫落時(shí)開始收集細(xì)胞及培養(yǎng)液于離心管中。將離心管在液氮及37℃水浴中反復(fù)凍融3次，離心收集上清。此上清即為Ad-NLRP3-shRNA第1代毒種(P1)，取1 ml上清作為毒種置于凍存管中-80℃保存。隨后取1 ml P1代病毒上清液，感染1個(gè)細(xì)胞密度>90%的10 cm培養(yǎng)皿。參照前述方法進(jìn)行收毒操作，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液于離心管，凍融3次后取上清液(P2)進(jìn)行下一代擴(kuò)增或-80℃保存。隨后的擴(kuò)增及收毒操作依此進(jìn)行。最終采用50%組織培養(yǎng)感染劑量法檢測(cè)病毒滴度。

1.2.3Ad-NLRP3-shRNA功能驗(yàn)證 待小鼠胰島beta細(xì)胞(Min6)以及單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)細(xì)胞培育密度達(dá)到80%時(shí)，接種置6孔板中進(jìn)行傳代培育，每孔為5×105細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長至70%融合時(shí)用Ad-NLRP3-shRNA感染細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)為100)。培養(yǎng)36 h后加入糖化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs，200 mg/L)或?qū)φ张Ｑ灏椎鞍?albumin bovine serum，BSA，200 mg/L)孵育24 h[8-9]，隨后收集MIN6細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)NLRP3基因表達(dá)。NLRP3基因引物序列為：上游5’-ATCAACAGGCGAGACCTCTG-3’，5’-GTCCTCCTGGCATACCATAG A-3’。

2 結(jié)果

2.1NLRP3 shRNA干擾質(zhì)粒鑒定 選擇陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，DNAMAN分析表明測(cè)序結(jié)果與NLRP3 shRNA序列一致(見圖1)，表明干擾序列已插入預(yù)計(jì)位點(diǎn)。

2.2Ad-NLRP3-shRNA包裝、收毒、擴(kuò)增及滴度測(cè)定結(jié)果 用成功構(gòu)建的小鼠NLRP3 shRNA穿梭質(zhì)粒和腺病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，顯微鏡下可見HEK 293細(xì)胞出現(xiàn)典型出毒現(xiàn)象(見圖2)，提示Ad-NLRP3-shRNA包裝成功。50%組織培養(yǎng)感染劑量法測(cè)定Ad-NLRP3-shRNA滴度為1×1010PFU/ml，體積1 ml。

圖1 NLRP3 shRNA1-3的基因測(cè)序圖

2.3Ad-NLRP3-shRNA對(duì)Min6和RAW264.7細(xì)胞中NLRP3基因表達(dá)的影響 RTQ-PCR結(jié)果表明Ad-NLRP3-shRNA1-3在Min6和RAW264.7細(xì)胞的干擾效率分別達(dá)到 44.38%、46.61%和82.83%以及47.23%、49.59%和78.64%(見圖3，P<0.05 vs. AGEs組)，其中Ad-NLRP3-shRNA 3的干擾效率最高。

圖2 Ad-NLRP3-shRNA細(xì)胞出毒現(xiàn)象

圖3 Ad-NLRP3-shRNA對(duì)Min6和RAW264.7細(xì)胞中NLRP3表達(dá)的影響

注：每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，#P<0.05 vs. BSA組，*P<0.05 vs. AGEs組

3 討論

RNA干擾(RNAi)技術(shù)是利用內(nèi)、外源性小分子雙鏈RNA(dsRNA)，誘導(dǎo)同源mRNA基因高度特異性降解的一種技術(shù)[10]。鑒于RNAi技術(shù)能夠特異性沉默或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以此技術(shù)在國內(nèi)外已被廣泛用于基因功能探索及基因治療領(lǐng)域[11]。目前RNAi包括siRNA和shRNA兩種方法。shRNA是根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)的類似雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA，相比于siRNA，具有更高的內(nèi)在穩(wěn)定性，并且在細(xì)胞內(nèi)沉默作用更加持久[12]，從而被廣泛運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)研究中。

NLRP3炎癥小體由NLRP3蛋白、凋亡相關(guān)微粒(ASC)蛋白和半胱氨酸蛋白酶原1(cysteine proteinogen 1)蛋白組成。激活后的NLRP3募集接頭蛋白ASC，并使pro-caspase 1活化為caspase 1，隨后裂解白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)前體等胞內(nèi)蛋白，最后分泌出有活性的IL-1β，對(duì)細(xì)胞造成損傷[13-15]。因此本實(shí)驗(yàn)針對(duì)小鼠NLRP3基因的編碼序列區(qū)設(shè)計(jì)并重組構(gòu)建了3個(gè)腺病毒干擾載體，再根據(jù)實(shí)際干擾的效率進(jìn)行篩選。AGEs是葡萄糖和含氨基生物分子(蛋白質(zhì)、核酸和脂類)通過非酶糖化作用緩慢形成的一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物。我們前期研究表明AGEs具有激活NLRP3炎癥小體的作用[16]。在本研究中，我們擬應(yīng)用AGEs上調(diào)細(xì)胞內(nèi)NLRP3基因表達(dá)，進(jìn)而更充分地探索Ad-NLRP3-shRNA的效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們所構(gòu)建的3種Ad-NLRP3-shRNA均可感染小鼠Min6和RAW264.7細(xì)胞，其中Ad-NLRP3-shRNA 3沉默NLRP3基因表達(dá)的效應(yīng)最優(yōu)，為進(jìn)一步研究NLRP3在代謝性炎癥中的作用提供了有效工具。