肖樹榮鄧益斌許桂丹彭彬農順強胡仁統(tǒng)黃晶晶韋家柱陳曉昊

(1. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，廣西 百色 533000；2. 廣西肝膽疾病臨床醫(yī)學研究中心，廣西 百色 533000；3. 廣東省陽江市人民醫(yī)院檢驗科，廣東 陽江 529500；4. 廣西百色市婦幼保健院保健科，廣西 百色 533000)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染已嚴重危害全球人類健康，其導致的慢性乙型肝炎呈流行性趨勢，長期持續(xù)性感染極易發(fā)展為肝硬化及肝癌[1-2]。目前臨床上抗HBV藥物雖多，但仍缺乏較理想效果的藥物。其中核苷(酸)類似物通過作用于逆轉錄酶抑制病毒復制，短期內具有抗病毒迅速、副作用較少等優(yōu)點[3-4]，但長期用藥會引起變異耐藥、腎臟等重要臟器損傷使治療無法達到滿意效果[5-6]。根據(jù)反基因治療的基本原理，主要就HBV編碼鏈設計特定的外源寡聚脫氧核苷酸片段，通過其與病毒雙鏈 DNA 的特定區(qū)域專一性結合，形成三鏈DNA 分子結構，達到阻斷靶基因的復制與轉錄，以期實現(xiàn)抑制病毒基因表達的目的[7]。課題組大量的前期研究結果顯示反基因治療能有效抑制HBV的復制與表達[8-12]，為了更深入探討反基因鎖核酸(anti-gene-locked nucleic acid，anti-gene，LNA)最優(yōu)抗病毒效果，特別針對HBV C編碼鏈設計反基因LNA，通過陽離子聚合物包裹反基因LNA進行轉染，經小鼠尾靜脈注射將反基因LNA導入肝細胞核內，同時與拉米夫定(lamivudine，LAM)比較其在HBV轉基因小鼠體內的抗病毒效果，以期發(fā)現(xiàn)較有效的抗病毒藥物。

1 材料與方法

1.1材料 HBV轉基因小鼠15只，其中雌性8只，體重20～26 g；雄性7只，體重25～33 g，購自中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院，實驗動物生產許可證號：SCXK(軍)2017-0016；陽離子聚合物轉染試劑(in vivo-jetPEI )為Polyplus公司(CPT201vQ)；反基因LNA由上海生工合成(111231052)；拉米夫定片購于葛蘭素史克制藥(蘇州)有限公司(H20030581)；HBsAg定量檢測試劑盒購于鄭州安圖生物工程有限公司(20190612)；HBV DNA定量測定試劑盒購于湖南圣湘生物科技有限公司(20153400083)。

1.2方法

1.2.1設計、篩選與合成反基因LNA片段 從NCBI/Genome數(shù)據(jù)庫中獲取ayw型HBV全基因序列(U95551.1;GI:2182117)，根據(jù)反基因寡核苷酸的作用原理，針對HBV C編碼鏈利用RNA structure軟件就2404～2418nt位點設計反基因鎖核酸片段，依據(jù)Walk(步移)功能選擇自由能值較小的片段：5’-CGA*CGCGGCGA*T*TGA*-3’，*代表修飾位置，經同源性分析序列，送上海生工合成和純化。

1.2.2陽離子聚合物包裹反基因LNA形成復合物 依據(jù)陽離子聚合物能包裹反基因LNA濃度范圍篩選試驗結果，選擇最佳藥物劑量，以每克HBV轉基因小鼠體重量注射0.5 μg的反基因LNA；將10%葡萄糖(GLU)反基因LNA混合液的稀釋至終濃度為5%葡萄糖反基因LNA混合液200 μl；陽離子聚合物的量與反基因LNA的量配(按陽離子聚合物的試劑說明書計算)，將10%葡萄糖陽離子聚合物稀釋至終濃度為5%葡萄糖陽離子聚合物溶液200 μl；將兩者溫和混勻并置室溫10 min備用。

1.2.3對HBV轉基因小鼠進行體內實驗 將15只HBV轉基因小鼠隨機分為3組(n=5)，分別為對照組(雌性3只和雄性2只)、拉米夫定灌胃組(雌性2只和雄性3只)、反基因LNA組(雌性3只和雄性2只)。對照組和反基因LNA組于1 d、3 d、5 d經尾靜脈分別注射5%GLU-陽離子聚合物的混合物400 μl和注射5%GLU-陽離子聚合物-反基因LNA的混合物400 μl。同時將拉米夫定組按2 mg/kg最佳劑量灌胃小鼠2次/天，連續(xù)用藥7 d。分別在給藥前和后1 d、3 d、5 d、7 d用微量吸管經小鼠眼眶靜脈采血，放置室溫30 min，經離心機12000 r/min離心15 min，將分離好的血清收集置無菌EP管中，貯存于-20℃冰箱備用。給藥后第10 d將小鼠溫和處死取肝、腎包埋并置-80℃保存。

1.2.6判斷HBV轉基因小鼠肝臟組織的HBsAg含量 將包埋好的小鼠肝臟進行快速切片，根據(jù)免疫組織化學法操作，并進行DAB染色，蘇木素復染，具體按試劑盒說明書操作。置熒光顯微鏡下觀察肝組織中HBsAg的著色情況，按一定順序計數(shù)200個細胞，計算HBsAg細胞陽性率=(陽性細胞數(shù)/200)×100%，以判斷反基因LNA對肝細胞內HBsAg的抑制作用。

1.2.7檢測HBV轉基因小鼠血清中肝、腎及心臟功能 根據(jù)生化分析法，嚴格按照全自動生化分析儀SOP文件進行操作，做好各項目質量控制，確保實驗室在控后對小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶(alanine Amiotransferase，ALT)、白蛋白(albumin，Alb)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Crea)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)等肝、腎和心功能指標進行檢測，判別陽離子聚合物-LNA混合物對小鼠各主要臟器功能的影響。檢測試劑盒ALT購于四川新健康成生物公司(0719061)、Alb購于邁瑞生物(148318002)、BUN購于上海執(zhí)誠生物(R7543)、Crea購于上海執(zhí)誠生物(CR7541)、CK購于邁克生物(0319011)。

1.2.8鏡下觀察HBV轉基因小鼠肝臟和腎臟組織結構改變 根據(jù)HE染色技術，小鼠肝臟和腎臟組織包埋和切片后，通過蘇木素及伊紅染色，玻片自然干燥后，置電子顯微鏡下觀察，判別小鼠肝臟和腎臟組織結構改變的情況，判定陽離子聚合物-LNA混合物對小鼠主要臟器結構的影響。

2 結果

2.1反基因LNA與拉米夫定對HBV 合成HBsAg的影響 與給藥前相比，拉米夫定組對HBV 合成HBsAg合成有一定的抑制作用(P<0.05)，而反基因LNA組則表現(xiàn)出較明顯的抑制作用(P<0.05)；第3 d、5 d、7 d與對照組相比，拉米夫定組對HBsAg合成的抑制作用尚不明顯(P>0.05)，而反基因LNA組則表現(xiàn)出較強的抑制作用(P<0.05)；給藥后的第1 d、3 d、5 d、7 d，反基因LNA組血清HBsAg的平均抑制率分別為20.37%、36.01%、44.73%、47.44%；拉米夫定組血清HBsAg的平均抑制率分別為2.17%、4.32%、5.40%、7.71%；見表1、表2。免疫組織化學結果顯示，與對照組HBsAg陽性細胞率(89.10±2.90)%相比，反基因LNA組肝組織中HBsAg陽性細胞率(39.3±4.90)%，P<0.05；而拉米夫定組(80.50±3.40)%，P>0.05，見圖1。

2.2反基因LNA與拉米夫定對HBV DNA的抑制效果 與給藥前相比，拉米夫定組對HBV DNA復制有一定的抑制效果(P<0.05)，而反基因LNA組則表現(xiàn)出較明顯的抑制效果(P<0.05)；第3 d、5 d、7 d與對照組相比，拉米夫定組對HBV DNA復制的抑制效果尚不明顯(P>0.05)，而反基因LNA組則表現(xiàn)出較強的抑制效果(P<0.05)；給藥后第1 d、3 d、5 d、7 d，HBV DNA的抑制率與給藥前相比，反基因LNA組的平均抑制率分別為19.45%、44.37%、51.33%、52.64%，拉米夫定組分別為2.54%、4.04%、5.84%、9.39%；見表3、表4。

表1 反基因LNA與拉米夫定對HBV合成HBsAg的影響

注：與對照組比較，a：P<0.05； 與拉米夫定組比較，b：P<0.05；與給藥前比較，c：P<0.05

表2 反基因LNA與拉米夫定對HBV合成HBsAg的抑制率

表3 反基因LNA與拉米夫定對HBV DNA復制的影響

注：與對照組比較，a：P<0.05； 與拉米夫定組比較，b：P<0.05；與給藥前比較，c：P<0.05

表4 反基因LNA與拉米夫定對HBV DNA的抑制率

2.4反基因LNA對肝、腎及心功能的影響 HE切片染色觀察到各組轉基因小鼠肝臟、腎組織結構無明顯改變，見圖2、圖3。檢測反基因LNA組血清ALT、Alb、BUN、Crea、CK等肝、腎和心功能指標，與對照組相比(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學意義，見表5。說明反基因LNA對小鼠的肝腎心功能及其組織結構無明顯影響。

圖1 各組肝臟組織中含HBsAg細胞的分布特點(免疫組化×200倍，

注：A：對照組；B：拉米夫定組；C：反基LNA組；D：拉米夫定組與對照組比較，#P>0.05；反基因LNA組與對照組比較，*P<0.05

圖2 各組肝臟切片組織結構鏡下形態(tài)學(HE 染色×200倍)

圖3 各組腎臟切片組織結構鏡下形態(tài)學(HE 染色×200倍)

表5 反基因LNA對肝腎心功能的影響

注：反基因LNA組的丙氨酸氨基轉移酶、白蛋白、血尿素氮、肌酐、肌酸激酶與對照組比較

3 討論

當前乙型肝炎抗病毒治療的目的在于穩(wěn)定抑制病毒復制來防止HBV引起的相關并發(fā)癥，如肝硬化和原發(fā)性肝癌。目前使用的核苷或核苷類似物恩替卡韋和替諾福韋酯的主要作用機制是通過靶向抑制病毒DNA聚合酶活性發(fā)揮抗病毒作用，雖然有較低的風險，但是需長期持續(xù)用藥，藥物抵抗常發(fā)生在病人抗病毒治療期間，其原因主要是由于HBV缺乏校對閱讀功能，導致乙肝病人患者體內大量病毒發(fā)生突變。特別在宿主免疫清除和抗病毒藥物作用下，更容易發(fā)生選擇性逃避突變和強烈影響感染病人體內主要HBV準種。

HBV是由3.2 kb組成具有包膜的部分雙鏈松弛環(huán)狀的DNA病毒，常被分為A-J 共10種基因型，各基因型之間的全基因組序列差異性>8%。基因組結構基本相似，包括S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)和 X 區(qū)4個開放讀碼區(qū)(open reading frame，ORF)，其中C區(qū)十分保守區(qū)，是基因治療的理想靶位。C區(qū)C基因是病毒裝配、成熟和分泌過程中重要的靶點。從而抑制病毒C基因表達，有可能降低HBV抗原的合成和抑制病毒的復制。未修飾的反基因序列因受到體內復雜環(huán)境影響，在與靶點特異性結合前可能已被完全降解。為了增強反基因LNA序列能抵抗核酸酶降解能力及熱穩(wěn)定性[13]，提高其與HBV結合的親和力[14- 16]，我們對反基因LNA片段進行修飾和純化。

依據(jù)反基因治療的作用機制，我們針對HBV C基因同聚嘌呤區(qū)2404～2418nt位點設計合成反基因LNA分子，與HBV C雙鏈 DNA 的特異性結合，形成穩(wěn)定的三鏈 DNA 分子結構，以陽離子聚合物為載體經尾靜脈注射轉染HBV轉基因小鼠，在肝內靶向結合病毒基因以達到封閉其表達的目的。靜脈注射給藥后第7 d結果顯示，反基因LNA組HBV DNA和HBsAg平均抑制率為52.64%和47.44%，明顯高于拉米夫定組的9.39%和7.71%，對HBV基因表達和肝細胞HBsAg合成有明顯的抑制作用。揭露了針對HBV C基因同聚嘌呤區(qū)設計合成的反基因LNA分子在體內可阻斷HBV復制和轉錄及抑制基因的表達。此外，未發(fā)現(xiàn)反基因LNA對HBV轉基因小鼠的肝、腎及心功能的檢測指標和肝、腎組織結構有明顯改變。實驗結果顯示，拉米夫定短期內抗病毒效果不理想，其原因是拉米夫定主要作用于HBV轉錄階段抑制酶的合成及蛋白表達，從而控制病毒的進展，需要長期規(guī)律用藥且易發(fā)生耐藥性突變。

因此，本研究主要針對HBV C基因同聚嘌呤區(qū)2404～2418nt位點設計合成的反基因LNA分子，在體內可阻斷HBV復制和轉錄及抑制基因的表達，為HBV提供有效的靶向性治療，以期找到有效的抗病毒反基因藥物分子，從而實現(xiàn)短期治療就能較好控制HBV感染者的可能，同時為反基因治療墊定一定的理論和實驗基礎。