李力 王亞平 饒犇 馬立新

摘要：為了提高表達(dá)L-谷氨酸氧化酶（LGOX）的重組大腸桿菌（pET-23a-lgox）的底物催化耐受性，嘗試了對重組菌進行固定化的研究。結(jié)果表明，產(chǎn)LGOX的重組大腸桿菌工程菌種的最佳固定化條件為：海藻酸鈉濃度2.5%，CaCl2溶液濃度13 g/L，pH 6.5，OD600 nm為14的工程菌與海藻酸鈉的最佳體積比1∶40，此時得到的固定化工程菌機械強度最好。通過酶學(xué)性質(zhì)比較發(fā)現(xiàn)，固定化的細(xì)胞與游離細(xì)胞在底物催化過程中相比，同等條件下前者溫度耐受性、pH耐受性、使用頻次等均高于后者。

關(guān)鍵詞：固定化細(xì)胞;海藻酸鈉;L-谷氨酸氧化酶

中圖分類號：Q814.2? ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）17-0132-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.035? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： In order to improve the substrate catalytic tolerance of recombinant E. coli（pET-23a-lgox） expressing L-glutamate oxidase（LGOX）， this study attempted to study the immobilization of recombinant bacteria. The results showed that the best immobilization conditions were 2.5% sodium alginate， 13 g/L CaCl2 solution， pH 6.5， and the optimal volume ratio of engineering bacteria（OD600 nm=14） to sodium alginate was 1∶40. At this time， the mechanical strength of the stationary engineering bacteria was the best. Through the comparison of enzymatic properties， it was found that the immobilized cells were more tolerant than free cells in the substrate catalysis process. And under the same conditions， their temperature tolerance， pH tolerance， and the use of frequency were higher than free cells.

Key words： immobilized cells; sodium glginate; L-glutamate oxidase

細(xì)胞固定化技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種新技術(shù)，是一種類似于酶的固定化技術(shù)，但是又區(qū)別于酶的固定化技術(shù)的一種新型固定化技術(shù)。細(xì)胞被固定化以后，繼續(xù)保持生命體征，在底物顆粒較小的情況下，能夠保持全細(xì)胞催化特性[1，2]，完成全細(xì)胞催化反應(yīng)。固定化細(xì)胞在對底物催化過程中，對環(huán)境一般具有較高的耐受性。因此，能進行全細(xì)胞催化活性的重組細(xì)胞都可以嘗試進行固定化研究，以期提高細(xì)胞的催化反應(yīng)使用效率。固定化細(xì)胞又稱固定化活細(xì)胞或者固定化增殖細(xì)胞，各種有功能的細(xì)胞都可以做成固定化細(xì)胞[3，4]。

固定化酶與固定化細(xì)胞的使用各有優(yōu)缺點，在應(yīng)用過程中善于取其優(yōu)點，避其缺點方能將酶的功能發(fā)揮到極致。固定化酶的優(yōu)點是催化反應(yīng)較靈活，酶與底物可以接觸，也很容易分離，可以反復(fù)使用，節(jié)約成本;缺點是對于一系列的酶促反應(yīng)效率不高[5-9]。固定化細(xì)胞的優(yōu)點是成本低，固定化細(xì)胞可以反復(fù)生長，反復(fù)使用，細(xì)胞與底物容易分開;缺點是固定化細(xì)胞只能針對低分子量底物進行反應(yīng)，底物與反應(yīng)集團接觸效率較低[1-4]。

L-谷氨酸氧化酶（LGOX）是一種黃素蛋白酶類，具有黃素腺嘌呤核苷酸（FAD）結(jié)合區(qū)域，專一性很好，能特異性地催化底物L(fēng)-谷氨酸，產(chǎn)生H2O2、氨和α-酮戊二酸，因在催化反應(yīng)過程中產(chǎn)生H2O2，反應(yīng)過程中的電子能夠被H2O2電極捕獲，所以常被用來制備傳感器應(yīng)用于臨床檢測、發(fā)酵生產(chǎn)、食品安全檢測等各個方面[10-12]。本研究通過基因合成的方法合成了來源于加納鏈霉菌（Streptomyces ghanaenis ATCC 14672）的L-谷氨酸氧化酶（LGOX）基因，將該基因克隆在大腸桿菌表達(dá)載體（pET23a）上[13]。測序正確的大腸桿菌表達(dá)載體通過常規(guī)轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌表達(dá)菌種BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)后獲得具有活性的LGOX，通過對該重組菌進行底物催化反應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，該酶可以實現(xiàn)全細(xì)胞底物催化反應(yīng)。該工程菌具備了制備固定化工程菌的條件，為此，本試驗嘗試了將該工程菌固定化，工藝條件為模式固定化，以期為該工程菌的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

L-谷氨酸：購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司;酵母提取物：購自英國Oxoid在中國的代理公司;Tryptone和蛋白胨：購自上海金畔生物科技有限公司代理（英國Oxoid）;YNB：購自上海金畔生物科技有限公司;N，N-二甲基苯胺、過氧化氫酶和4-氨基比林：購自西格瑪奧德里奇有限公司;葡萄糖、tris-base、KH2P04、NaOH、KCl等：購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等常用的試劑盒購自天根生化科技有限公司;海藻酸鈉、戊二醛、氯化鈣等化學(xué)試劑購自濰坊玉鼎化工有限公司;其他常用的試劑耗材購買于武漢市漢陽區(qū)貝創(chuàng)科瑞生物試劑經(jīng)營部。

1.2? 儀器設(shè)備

各種電泳設(shè)備購自北京六一生物科技有限公司;各種型號離心機購自Eppendorf公司;移液器購自Eppendorf、Ruining、吉爾森等各公司;溫控?fù)u床等常用的微生物學(xué)設(shè)備購自北京蘭貝石恒溫技術(shù)有限公司;無菌操作臺購自江蘇蘇凈集團有限公司;超純水儀購自密理博生物器材廠;磁力攪拌器購自武漢市洪山區(qū)中心科創(chuàng)實驗器材經(jīng)營部;其他小型設(shè)備購自國內(nèi)各種儀器設(shè)備公司。

1.3? 大腸桿菌發(fā)酵液的制備方法

將重組大腸桿菌的種子液按1%的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃條件下，140 r/min搖菌約2 h;當(dāng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)到OD600 nm為0.6～0.8時，加入終濃度為0.8%的乳糖，28 ℃下誘導(dǎo)12 h;4 ℃，12 000 r/min下離心2 min，倒掉上清液;用緩沖液重懸菌體備用。

1.4? 固定化細(xì)胞的制備方法

取OD600 nm≈14的菌體與2.5%的海藻酸鈉（V/V≈1/5），在磁力攪拌器上充分混勻;吸取混合液，5～10 cm高處將混合液滴入13 g/L的CaCl2溶液中，形成光潔的小球微粒;將小球微粒置于13 g/L的CaCl2溶液中，4 ℃靜置3 h;過濾取出小球，用生理鹽水儲存，4 ℃靜置備用。

1.5? 固定化細(xì)胞酶活的測定方法

取固定化細(xì)胞適量，與11 mg/mL的L-谷氨酸500 μL，60 U/mL辣根過氧化物10 μL，0.261 μg/mL N，N-二甲基苯胺140 μL，0.122 μg/mL 4-氨基安替比林100 μL，在對應(yīng)酶的最適反應(yīng)條件下在磁力攪拌器上反應(yīng)0.5 h，過濾掉小球，取上清[13]。冷卻至常溫于550 nm測吸光值。

酶活計算按照如下公式：L-谷氨酸氧化酶活力（U/g）=A550 nm/14.3×3.1/0.1×1/20×稀釋倍數(shù)，其中，14.3為提取常數(shù)，3.1為反應(yīng)總體積（mL），20為反應(yīng)時間（min）。L-谷氨酸氧化酶定義為，在酶的最適催化反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1 μmol的H2O2所需要的LGOX的酶量為即為1 U的酶活。來測定固定化細(xì)胞的酶活。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 固定化條件分析

2.1.1? 海藻酸鈉濃度對固定化小球穩(wěn)定性的影響? 取濕重為1 g的重組大腸桿菌與不同濃度的海藻酸鈉溶液包埋，制備固定化細(xì)胞，反應(yīng)6 h后肉眼觀察計算固定化小球的完好率，結(jié)果見表1。由表1可見，當(dāng)海藻酸鈉的濃度為2.5%時，固定化細(xì)胞反應(yīng)6 h后，固定化小球完好率最高，固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性更好。說明本工程菌種中的特有離子對于海藻酸鈉不可逆的凝結(jié)，在海藻酸鈉的濃度為2.5%的時候達(dá)到最好的狀態(tài)。

2.1.2? CaCl2濃度對固定化小球穩(wěn)定性的影響? 海藻酸鈉包埋工程菌主要依賴于Ca2+作為中間的連接，使得海藻酸鈉形成有鏤空的顆粒，從而包埋工程菌，因此CaCl2的濃度和凝結(jié)時間是海藻酸鈉作為包埋劑的主要因素。

通過不同濃度的CaCl2檢測固定化細(xì)胞的儲備液環(huán)境對固定化細(xì)胞穩(wěn)定性的影響。將固定化的細(xì)胞置于不同濃度的CaCl2溶液中，反應(yīng)12 h后，肉眼觀察并計算固定化細(xì)胞的完好率，判斷CaCl2濃度對固定化細(xì)胞穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，當(dāng)CaCl2濃度為13 g/L時，小球的穩(wěn)定性最好。說明對于本工程菌而言，當(dāng)CaCl2濃度大于11 g/L時凝集效率最好，得到的固定化小球機械強度最大。

2.1.3? 菌液與海藻酸鈉體積比對小球穩(wěn)定性的影響? 取2.5%的海藻酸鈉與不同體積比的OD600 nm=14的重組大腸桿菌菌體進行包埋，制備固定化細(xì)胞，并在13 g/L的CaCl2儲備6 h后，測定固定化小球穩(wěn)定性，結(jié)果見圖1。通過肉眼觀察計算小球穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)菌體與海藻酸鈉體積比在1∶40的時候，能夠更大程度地固定重組細(xì)胞，提高細(xì)胞的固定化效率。從以上的結(jié)果可以看出，當(dāng)菌體與海藻酸鈉的體積比為1∶40時，固定化小球的穩(wěn)定性良好，對于重組菌進行固定化細(xì)胞酶促反應(yīng)最有利。

2.1.4? 正交試驗設(shè)計及結(jié)果? 根據(jù)單因素試驗，設(shè)計單因素A海藻酸鈉濃度（2.0%、2.5%、3.0%）、B氯化鈣濃度（9、13、17 g/L）、C菌體（注：菌體OD600 nm=14）與海藻酸鈉體積比（1∶30、1∶40、1∶50）、D固定化時間（4、8、12 h）進行4因素3水平的正交試驗，試驗指標(biāo)為固定化小球的機械強度，篩選最佳固定化工藝條件[14，15]，具體見表3。方差分析結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，固定化的時間對小球穩(wěn)定性的影響并不是很大，但是在一定范圍內(nèi)，海藻酸鈉的濃度和CaCl2的濃度對小球的穩(wěn)定性具有交互影響，從方差試驗結(jié)果中可以推斷出，產(chǎn)LGOX重組菌的最佳固定化條件是海藻酸鈉濃度2.5%，CaCl2濃度13 g/L，菌體負(fù)載量1∶40，固定化時間4 h為宜。

2.2? 固定化細(xì)胞與全細(xì)胞酶促反應(yīng)比較

參照測L-谷氨酸氧化酶酶學(xué)性質(zhì)的方法，比較全細(xì)胞與固定化細(xì)胞在酶催化反應(yīng)中的酶學(xué)性質(zhì)，利用全細(xì)胞或者固定化細(xì)胞與11 mg/mL的L-谷氨酸作為底物，反應(yīng)0.5 h后，4 ℃條件下，6 000 r/min離心5 min，按照L-谷氨酸氧化酶活性的測定方法，測定兩種酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH，得到結(jié)果見圖2。測試結(jié)果表明，全細(xì)胞和固定化細(xì)胞在底物催化過程中，最適反應(yīng)pH都在6.5左右，只是固定化細(xì)胞的適應(yīng)pH要比全細(xì)胞廣泛，pH 5.5～7.5都能保持較高（80%以上）的相對酶活（圖2A）;從圖2B中可以看出，固定化后的細(xì)胞在反應(yīng)過程中溫度耐受性也有所提高。

2.3? 固定化細(xì)胞使用頻次分析

對表達(dá)LGOX的重組大腸桿菌進行誘導(dǎo)表達(dá)，達(dá)到誘導(dǎo)表達(dá)的最高酶活后，對細(xì)胞進行固定化，對固定化的細(xì)胞進行使用頻次研究，每次使用固定化細(xì)胞在最適條件下催化0.5 h后，過濾收集，直到使用相應(yīng)的次數(shù)，催化11 mg/mL的L-谷氨酸（鹽）的底物，并測定酶活，繪制曲線圖見圖3。結(jié)果表明，固定化細(xì)胞的使用要比全細(xì)胞在酶催化的過程中有更好的耐受性。細(xì)胞在固定化之后，使用50次以后還能保持80%左右的相對酶活。推測可能原因是全細(xì)胞在酶催化的過程中更容易受到催化反應(yīng)體系的高滲透壓的破壞，耐受性比固定化細(xì)胞的耐受性差。

3? 小結(jié)

通過固定化細(xì)胞和全細(xì)胞的酶學(xué)性質(zhì)分析比較發(fā)現(xiàn)，固定化表達(dá)L-谷氨酸氧化酶的大腸桿菌，固定化細(xì)胞的pH和溫度適應(yīng)性比全細(xì)胞更加廣泛，固定化細(xì)胞比全細(xì)胞直接反應(yīng)表現(xiàn)出相對較好的溫度耐受性和pH耐受性。

通過對固定化細(xì)胞的使用頻次研究發(fā)現(xiàn)，固定化細(xì)胞比全細(xì)胞反應(yīng)使用頻次更多，含有酶的固定化細(xì)胞酶活穩(wěn)定性更好，溫度耐受性相對較好。細(xì)胞的固定化為L-谷氨酸氧化酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。固定化表達(dá)L-氨基酸氧化酶的細(xì)胞成功對底物L(fēng)-谷氨酸進行催化反應(yīng)，也為利用L-氨基酸氧化酶制備生物傳感器在食品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、臨床診斷方面的應(yīng)用提供了新思路。

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