王崇 楊新筍 雷劍 蘇文瑾 柴沙沙 張文英 王連軍

摘要：以抗病蟲相關(guān)基因SGT1作為靶標(biāo)基因，設(shè)計(jì)出1條固定引物，與11條隨機(jī)引物組合。利用這11對引物對試驗(yàn)材料鄂薯11和鄂紫薯13進(jìn)行TRAP-PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)11對引物組合擴(kuò)增出清晰條帶，且表現(xiàn)出良好的多態(tài)性。研究獲得與SGT1基因相關(guān)聯(lián)的TRAP標(biāo)記，該標(biāo)記可進(jìn)行甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]群體的遺傳多樣性分析，為甘薯的抗病蟲育種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.];抗病蟲;SGT1基因;TRAP標(biāo)記

中圖分類號：Q789;S531? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）17-0119-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.032? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Disease and pest resistance related gene SGT1 was used as a target gene to design a fixed primer，then for paring 11 pairs primers with 11 arbitrary primers. The 11 pairs of primers were used to amplify Eshu 11 and Ezishu 13 by TRAP-PCR. It was found that 11 pairs of primer combinations amplified clear bands and showed good polymorphism. In this study， TRAP markers associated with SGT1 gene were obtained， which can be used to analyze the genetic diversity of sweetpotato[Ipomoea batatas（L.） Lam.] population， and provide theoretical basis for disease and insect resistance breeding of sweetpotato.

Key words： sweetpotato[Ipomoea batatas（L.） Lam.]; disease and insect resistance; SGT1 gene; TRAP marker

甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]是世界上重要的糧食、飼料、工業(yè)原料及新型能源用塊根作物，中國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國，常年種植面積550萬hm2，鮮薯產(chǎn)量約1.2億t，分別占世界甘薯種植總面積和總產(chǎn)量的60%和85%[1]。甘薯在遺傳上高度雜合，種內(nèi)、種間雜交不親和以及遺傳資源匱乏，遺傳基礎(chǔ)狹窄，病蟲害、病毒病危害嚴(yán)重，嚴(yán)重制約了甘薯品種的遺傳改良[2]。在目前的甘薯育種中，亟須開發(fā)出能夠與目標(biāo)性狀或相關(guān)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。

SGT1（Suppressor of the G2 allele of skp1）基因主要功能是調(diào)控著絲粒的裝配，并調(diào)節(jié)泛素對目標(biāo)靶蛋白的修飾[3]。研究發(fā)現(xiàn)，SGT1基因發(fā)生沉默或基因突變，植物對R基因引起的病害抗性變?nèi)?，如果SGT1基因在植物體內(nèi)過表達(dá)，則植物對病原微生物的抗性有所增強(qiáng)[4]。在植物體內(nèi)，SGT1與HSP90（Heat shock protein，熱激蛋白90）和RAR1（Required for Mla12 resistance）形成復(fù)合體，在抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要角色[5，6]。雖然抗病調(diào)控相關(guān)基因SGT1不是起著直接作用，但是它在植物抗病中占有不可或缺的地位[7]。SGT1對細(xì)菌、真菌、病毒和線蟲等病原均具有抗病反應(yīng)，起到重要的調(diào)控作用[8-10]。

TRAP技術(shù)[11]是由SRAP技術(shù)[12]發(fā)展而來，具有簡單、高效、重復(fù)性好、效率高等優(yōu)點(diǎn)，已在菜豆[13]、小麥[14]、煙草[15]、棉花[16]等多種作物中得到了廣泛應(yīng)用。本研究以抗病基因作為靶標(biāo)基因，開發(fā)設(shè)計(jì)TRAP標(biāo)記引物，旨在評價(jià)分析TRAP標(biāo)記技術(shù)在甘薯研究中的利用價(jià)值，發(fā)掘出有效的與SGT1緊密連鎖的TRAP標(biāo)記，為篩選甘薯抗病品種提供一定的理論依據(jù)，為甘薯抗病蟲遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料為高抗蔓割病、抗根腐病和莖線蟲病、感黑斑病的甘薯品種鄂薯11;感蔓割病、高感根腐病、中抗莖線蟲病、高感黑斑病的甘薯品種鄂紫薯13。通過海南和武漢兩地田間調(diào)查小象甲危害指數(shù)，鄂薯11受危害程度比鄂紫薯13輕。鄂薯11和鄂紫薯13種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗(yàn)田。

1.2? 引物設(shè)計(jì)

利用Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物。根據(jù)NCBI登錄號搜索到SGT1基因序列，以SGT1基因作為靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)1條固定引物，固定引物大小為18 bp，退火溫度為50 ℃，參考引用Li等[17]已發(fā)表的11條隨機(jī)引物（表1），均委托天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司（武漢）合成。

1.3? DNA的提取

采取鄂薯11、鄂紫薯13的新鮮幼嫩葉片，采用改良CTAB法[18]提取甘薯總DNA。將DNA稀釋到PCR反應(yīng)所需的濃度（50～60 ng/μL），在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4? TRAP反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析

使用S1000TM Thermal Cycler（BioRad）PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10×buffer（Mg2+）5.0 μL，dNTPs（10 mmol/L each）4.0 μL，固定引物1.0 μL，隨機(jī)引物1.0 μL，基因組 DNA（50～60 ng/μL）1.0 μL，Easy-Taq DNA Polymerase 0.5 μL，dd H2O補(bǔ)至總體積為50 μL;TRAP反應(yīng)的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán);然后94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min，慢慢冷卻至10 ℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）上電泳，105 V電泳4 h，銀染，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

2? 結(jié)果與分析

2.1? TRAP標(biāo)記的多態(tài)性分析

使用11對TRAP引物對2個(gè)試驗(yàn)材料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)11對引物擴(kuò)增片段主要集中在100～900 bp范圍內(nèi)，每對引物組合可產(chǎn)生8～20條清晰、穩(wěn)定條帶，不同TRAP引物組合擴(kuò)增出的帶型、條帶數(shù)量和分布均勻程度具有較大差異。11對引物組合均表現(xiàn)出多態(tài)性，產(chǎn)生的多態(tài)性條帶為4～10條，其中ST/me1、ST/me2、ST/em2、ST/em4等4對引物組合的多態(tài)性更為良好，可用于進(jìn)一步分析研究（圖1）。

2.2? SGT1基因的TRAP分析

對11對引物組合擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶進(jìn)行分析，主要集中在200～700 bp。鄂薯11與鄂紫薯13的抗性存在差異，發(fā)現(xiàn)某些條帶在鄂薯11中出現(xiàn)，而在鄂紫薯13中沒有產(chǎn)生條帶。如圖1箭頭所指，組合ST/me1在鄂薯11中擴(kuò)增出3條特異性條帶，鄂紫薯13中沒有出現(xiàn);引物組合ST/em2在鄂薯11中擴(kuò)增出4條特異性條帶，而鄂紫薯13中沒有出現(xiàn)這4條特異性條帶。在這些多態(tài)性條帶中，可能存在SGT1基因的特異擴(kuò)增條帶，這些片段可能與SGT1基因緊密相關(guān)。接下來可以對這些特異性片段進(jìn)行回收、測序，做進(jìn)一步的研究。

3? 小結(jié)與討論

通過基因克隆，發(fā)現(xiàn)SGT1基因在植物抗病中起到重要作用。李為民等[19]發(fā)現(xiàn)GbSGT1基因在海島棉的抗黃萎病中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)經(jīng)過黃萎病菌誘導(dǎo)后，GbSGT1基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量顯著提高。王凱等[20]研究發(fā)現(xiàn)，小麥體內(nèi)SGT1基因的超量表達(dá)可以提高對黃矮病、白粉病的抗性。Xing等[21]將來自簇毛麥的SGT1基因?qū)肫胀ㄐ←湥l(fā)現(xiàn)對白粉病的抗性增強(qiáng)。蔣明等[22]以青花菜為試驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)霜霉菌和核盤菌誘導(dǎo)BoSGT1的過量表達(dá)，表明BoSGT1基因?qū)λ咕秃吮P菌具有抗性。Uppalapati等[23]發(fā)現(xiàn)，在抑制SGT1表達(dá)的情況下，在受丁香假單胞菌侵染時(shí)，番茄和擬南芥葉片出現(xiàn)失綠和細(xì)胞死亡等病癥。這些研究揭示了SGT1基因的多種抗病反應(yīng)機(jī)制，為植物抗病基因工程的應(yīng)用提供了更多的選擇。

TRAP技術(shù)的固定引物是基于EST序列設(shè)計(jì)的，是表達(dá)基因的一部分，因此通過開發(fā)與表型或目標(biāo)基因連鎖的TRAP標(biāo)記，被有效地應(yīng)用于特定的基因定位。Miklas等[24]通過設(shè)計(jì)大豆的TRAP固定引物，在106個(gè)TRAP標(biāo)記中有17個(gè)定位了與R基因相鄰的基因，2個(gè)調(diào)節(jié)灰莖枯萎病抗性，1個(gè)具有大豆花葉病毒抗性和共同的細(xì)菌抗性，證明TRAP標(biāo)記具有標(biāo)記抗病性基因的潛力。Saleh等[25]通過構(gòu)建小麥Yecora Rojo和Pavon 76的F4群體，發(fā)現(xiàn)3個(gè)與葉綠素含量性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，4個(gè)與葉片衰老相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記和3個(gè)與葉片細(xì)胞膜穩(wěn)定性相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，表明TRAP標(biāo)記可以用于小麥的抗干旱育種。Chen等[26]結(jié)合SSR、SRAP和TRAP標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與小麥抗條銹病相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，證實(shí)YrSph可能是一個(gè)新型的小麥抗條銹病基因。張娜等[27]將TRAP技術(shù)在小麥抗葉銹病基因中Lr24的分子標(biāo)記中應(yīng)用成功，得到1個(gè)與Lr24緊密連鎖的TRAP標(biāo)記，可用于篩選抗葉銹病基因的群體。

甘薯小象甲是甘薯的一類重要病害，能造成甘薯的大面積減產(chǎn)[28]。研究發(fā)現(xiàn)SGT1和HSP90共同介導(dǎo)參與根線蟲、馬鈴薯蚜蟲和甘薯白蠅的抗性[29]，據(jù)此推測，SGT1基因可能也參與甘薯抗小象甲的調(diào)控。TRAP標(biāo)記在種質(zhì)資源的鑒定評價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀基因標(biāo)記、圖位克隆、cDNA與gDNA指紋分析等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[30，31]。本研究利用TRAP技術(shù)對鄂薯11和鄂紫薯13進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)某些條帶在鄂薯11中出現(xiàn)，而在鄂紫薯13中無法檢測到，這些條帶可能與甘薯抗病和抗蟲基因有著緊密聯(lián)系，表明TRAP標(biāo)記可能在甘薯的抗病和抗蟲遺傳改良中有著應(yīng)用價(jià)值。

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