葉繁，馮時歡，吳佳佳, ，戴志遠,

1. 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2. 中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；3. 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州 310012

抗生素濫用不斷誘導(dǎo)細菌對抗生素產(chǎn)生抗性，目前，抗生素耐藥基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）已成為難以降解的新型環(huán)境污染物。ARGs能在環(huán)境中長期殘留，并在細菌菌群間遷移，同時可能通過直接接觸或食物鏈污染等多種途徑進入人體，增加人體的抗生素抗性，使細菌感染性疾病的治療更加棘手（崔澤林等，2011）。中國水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素濫用問題普遍，加之水體中抗生素本底水平較高，進而使水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的檢出率不斷增加，一些水產(chǎn)養(yǎng)殖動物攜帶ARGs也被不斷檢出（黃志堅等，2012）。

喹諾酮類抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是目前中國對蝦養(yǎng)殖業(yè)中常用的兩類抗生素。王敏等（2011）在濱海典型養(yǎng)殖區(qū)的不同養(yǎng)殖水環(huán)境中采集樣本，從中檢測出了3類7種抗生素殘留，其中，喹諾酮類藥物諾氟沙星在蝦池的檢出量最高，為3.54 ng·L-1。郭鵬（2009）對44株水產(chǎn)源嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星、恩諾沙星抑菌率分別達97.67%、97.67%。葛錚（2015）從淡水魚類中分離獲得維氏氣單胞菌（Ae. veronii），測定最小抑菌濃度，結(jié)果表明分離的維氏氣單胞菌對慶大霉素、阿莫西林、紅霉素全部耐藥；對環(huán)丙沙星、恩諾沙星的耐藥率分別為78.85%、57.69%。Vaseeharan et al.（2008）在印度對蝦養(yǎng)殖場采集的細菌中發(fā)現(xiàn)有47.4%的細菌對紅霉素敏感。中國水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的污染情況正愈發(fā)嚴重，并呈現(xiàn)多元化、復(fù)雜化的局面（張騫月，2016），著手水產(chǎn)環(huán)境 ARGs污染研究，對指導(dǎo)抗生素科學(xué)、合理使用，控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中ARGs污染并阻止其通過食物鏈遷移至人體、保障水產(chǎn)食品安全意義深遠。

本研究以杭州蕭山地區(qū)南美白對蝦養(yǎng)殖環(huán)境的微生物為研究對象，利用抗性平板進行抗生素抗性細菌初步篩選；借助16S rDNA序列分析技術(shù)探究分離菌株的分類信息；同時，對分離菌株 ARGs進行PCR擴增檢測。研究結(jié)果可為掌握水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)中ARGs的污染現(xiàn)狀、了解其對養(yǎng)殖系統(tǒng)生態(tài)環(huán)境的影響、評估ARGs帶來的生態(tài)風(fēng)險提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

水樣和泥樣采集于杭州市蕭山圍墾某養(yǎng)殖廠的1號蝦塘和2號蝦塘，樣品置于無菌自封袋中，低溫（冰?。┻\回實驗室，置于4 ℃冰箱中保存，并在24 h內(nèi)進行微生物分離實驗。1號塘為露天養(yǎng)殖塘；2號塘為大棚養(yǎng)殖塘（該塘藍藻爆發(fā)，水體富營養(yǎng)化）。

2216E培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；瓊脂糖（Agarose，北京沃比森科技有限公司）；諾氟沙星（Norfloxacin）、紅霉素（Erythromycin）購自上海阿拉丁生化科技有限公司；細菌基因組DNA小量提取試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）。

1.2 耐藥菌的培養(yǎng)與計數(shù)

取20 g泥樣（或20 mL水樣）溶于含180 mL 0.85%無菌生理鹽水。梯度稀釋后分別涂布于2216E瓊脂平板、含諾氟沙星（16 mg·L-1）2216E瓊脂平板和含紅霉素（8 mg·L-1）2216E 瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h，分別對3種平板上的細菌數(shù)量進行計數(shù)。

1.3 菌株純化

從上述諾氟沙星和紅霉素抗性平板上隨機挑選菌落形態(tài)有明顯差異的菌株進行兩次劃線純化培養(yǎng)，并將第二次分離純化后的單菌落接種到含 5 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h，獲得新鮮菌液，取一定量新鮮菌液與等體積70%無菌甘油混合后于-80 ℃凍藏，備用。

1.4 細菌DNA提取

取新鮮菌液3 mL，按照細菌基因組DNA小量提取試劑盒說明書操作步驟進行細菌DNA提取和純化。采用Nanodrop MN-913超微量分光光度計測定提取 DNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。

表1 擴增引物序列Table 1 Primers for ARGs amplification

1.5 ARGs PCR擴增

以細菌基因組DNA為模板，采用25 μL反應(yīng)體系進行 PCR 擴增。反應(yīng)體系：2.5 μL 10×LA buffer(Mg2+plus)，2 μL dNTP Mix（2.5 mmol·L-1），引物各 1 μL，0.2 μL LA Taq（5 U·μL-1），1 μL DNA 模板，17.3 μL ddH2O。引物序列見表1。

反應(yīng)條件：

（1）gyrA：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 30 s，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

（2）ermB：93 ℃預(yù)變性3 min；93 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，隨機挑取部分陽性擴增產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對。

1.6 16S rDNA PCR擴增

以細菌基因組DNA為模板，參考袁開等（2017）方法完成16S rDNA的擴增。50 μL反應(yīng)體系：5 μL 10×LA buffer（Mg2+plus），4 μL dNTP Mix （2.5 mmol·L-1），引物各 3 μL，0.3 μL LA Taq（5 U·μL-1），1 μL DNA模板，33.7 μL ddH2O。擴增產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進行序列測定，測序結(jié)果在 NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，并基于MEGA 5.1軟件構(gòu)建耐藥菌的系統(tǒng)進化樹（Saitou et al.，1987；Felsenstein，1985；Tamura et al.，2004；Tamura et al.，2011）。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

運用Origin 2017進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并作圖；運用 MEGA 5.1進行進化樹構(gòu)建，采用最大似然法（maximum composite likelihood method）和鄰接法（neighbour-joining method）構(gòu)建進化樹，Boostrap值為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖蝦塘中耐藥菌的分布

4個采樣點細菌總數(shù)統(tǒng)計結(jié)果表明，2號泥樣中可培養(yǎng)菌落總數(shù)最高，為 1.1×107CFU·mL-1，1號水樣可培養(yǎng)菌落總數(shù)最低，為2.0×105CFU·mL-1。如圖1所示，4個采樣點均存在耐紅霉素細菌，而耐諾氟沙星細菌只存在于底泥樣品中。雖然水樣細菌在諾氟沙星抗性平板上未出現(xiàn)菌落，但不能完全代表蝦塘中不存在耐諾氟沙星細菌，由于實驗室培養(yǎng)條件并不能完全模擬蝦塘生長環(huán)境，許多環(huán)境細菌并不能在人工培養(yǎng)條件下生長繁殖。養(yǎng)殖蝦塘細菌對紅霉素耐藥率較高，且耐紅霉素細菌數(shù)比耐諾氟沙星細菌數(shù)高1－2個數(shù)量級。1號和2號蝦塘泥樣細菌對諾氟沙星的耐藥率分別為0.36%、0.82%；1號蝦塘泥樣和水樣中細菌對紅霉素的耐藥率分別為23.33%、18.50%，2號蝦塘泥樣和水樣中細菌對紅霉素的耐藥率分別為20.00%、12.50%。

圖1 養(yǎng)殖蝦塘中菌落總數(shù)及抗生素耐藥率Fig. 1 Total number of colonies and antibiotic resistance rate of the bacteria in shrimp ponds

2.2 ARGs PCR檢測

4個采樣點均存在耐紅霉素細菌，而耐諾氟沙星細菌只存在于底泥樣品中。在 6個抗性平板上分別挑選10株菌進行分離培養(yǎng)，即20株耐諾氟沙星菌株和40株耐紅霉素菌株，共計60株。采用細菌基因組 DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，并以其為模板進行耐藥基因的PCR擴增。

60株菌株耐藥基因PCR檢測結(jié)果顯示，在16株菌株中檢出gyrA基因，在30株菌株中檢出ermB基因，片段大小與預(yù)期擴增片段大小一致（見圖2、圖 3）。

圖2 部分菌株ermBPCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 PCR amplicons of ermB

兩種ARGs檢出率如下：喹諾酮類ARGs gyrA基因的檢出率為26.67%，大環(huán)內(nèi)酯類ARGs ermB基因的檢出率50.00%。另外按蝦塘分類，1號蝦塘gyrA基因的檢出率較高，為43.33%；ermB基因的檢出率較低，為30.00%；2號蝦塘gyrA基因的檢出率為10.00%，ermB基因的檢出率為70.00%。

圖3 部分菌株gyrA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 3 PCR amplicons of gyrA

2.3 菌株鑒定結(jié)果

隨機挑取陽性擴增產(chǎn)物菌株進行鑒定，結(jié)果如表2。

Blast比對結(jié)果顯示，所得21個16S rDNA基因序列與 Genebank核酸數(shù)據(jù)庫中已有序列相似性達 99%－100%，具體鑒定結(jié)果如下：南極適冷菌（Rheinheimera sp.）7株、不動桿菌（Acinetobacter sp.）6株、微桿菌（Microbacterium sp.）3株、廈門希瓦氏菌（Shewanella xiamenensis）2株、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）2株、豚鼠氣單胞菌（Ae. caviae）1株。1號蝦塘共鑒定出2個屬，66.67%為不動桿菌屬，33.33%為微桿菌屬；2號蝦塘共鑒定出3個屬，3個種，其中南極適冷菌最多，占58.33%，其余包括廈門希瓦氏菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌。耐藥基因PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)Blast比對分析后表明，1號蝦塘中所測菌株擴增出的gyrA基因序列與約氏不動桿菌（Ac. johnsonii）的相應(yīng)耐藥基因序列的相似性均為97%；而2號蝦塘中所測菌株擴增出的 gyrA基因序列與奧奈達希瓦氏菌（Sh. oneidensis）相應(yīng)的耐藥基因序列的相似性均為97%，2號蝦塘中挑取的ermB基因序列均與釀膿鏈球菌（St. pyogenes）相應(yīng)的耐藥基因序列相似度最高（99%－100%）。

2.4 16S rDNA系統(tǒng)進化分析

從Genebank選取模式菌株16S rDNA序列，與21株測序菌株的16S rDNA序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖 4。獲得的菌株分布于變形菌門和放線菌門2個門級分類單元中，除菌株1-4、1-5、1-8與放線菌門的Microbacterium aureliae遺傳距離較近外，其余菌株均聚類于γ-變形菌綱。2號蝦塘大部分菌株的遺傳特征比較接近，菌株2-1、2-3、2-5、2-6、2-7、2-8、2-10與Rheinheimera soli的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切；1號蝦塘多數(shù)菌株與 Ac. johnsonii聚為一簇。

表2 菌株鑒定結(jié)果Table 2 Bacterial typing and identification

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，蝦塘泥樣中菌落總數(shù)及耐藥菌總數(shù)均高于其對應(yīng)水樣中的數(shù)量，這是因為蝦塘中細菌數(shù)量主要決定于有機物的濃度（劉國才等，2000）；而在養(yǎng)殖池塘系統(tǒng)中，大量殘餌、生物代謝物、生物殘體等有機物不斷沉積在池底，使得底泥環(huán)境更有利于細菌繁殖生長（李爍寒等，2009）。Gao et al.（2012）通過對天津市6個水產(chǎn)養(yǎng)殖場中的四環(huán)素類抗性基因和磺胺類抗性基因及抗性菌株進行檢測，發(fā)現(xiàn)底泥中抗藥細菌數(shù)量和抗生素抗性基因濃度都遠高于水中，說明沉積物可能是抗性細菌和抗性基因的重要儲存庫。

已有研究報道指出，在水產(chǎn)養(yǎng)殖場的動物體內(nèi)和環(huán)境中發(fā)現(xiàn)多重抗藥菌株的存在。Novick（1981）指出在動物養(yǎng)殖業(yè)中使用亞治療劑量的抗生素會促進產(chǎn)生多重抗藥性菌株。Tendencia et al.（2001）在菲律賓的一個蝦塘中發(fā)現(xiàn)與未使用過抗生素的池塘相比，使用過惡喹酸的蝦塘里出現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象的菌株更多。本研究基于PCR檢測耐藥菌株中的耐藥基因，也發(fā)現(xiàn)1號蝦塘和2號蝦塘中各存在2株菌株出現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象。

對蝦塘中分離耐藥菌鑒定結(jié)果顯示，1號、2號蝦塘中分布的耐藥細菌種類不盡相同。其中，1號蝦塘耐藥菌以不動桿菌為主，2號蝦塘中南極適冷菌所占比例最高，其次為希瓦氏菌屬和氣單胞菌屬。不動桿菌、希瓦氏菌、嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌為致病菌，容易引起細菌性疾病，在機體免疫力下降時還會引起人體胃腸道、肺部等部位感染，微桿菌和南極適冷菌的致病性尚未明確。嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌是對蝦養(yǎng)殖中的常見條件致病菌，容易引起紅腿病、爛鰓病、敗血病等（徐曉津等，2001）。氣單胞菌利用能量的能力較強，當水體富營養(yǎng)化后，就會優(yōu)先利用有機物進行繁殖，從而抑制其他細菌的繁殖，使水體中物質(zhì)循環(huán)受到阻礙（羅璋，2007）。采樣期間 2號蝦塘正值藍藻爆發(fā)，水體處于富營養(yǎng)化狀態(tài)，這可能是其中氣單胞菌較1號蝦塘多的原因。

圖4 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

本研究鑒定的細菌最終歸屬于2個綱5個屬，其中γ-變形菌綱數(shù)量最多。Nair et al.（2012）研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門和厚壁菌門是河水、海水以及海洋底泥中的主要類群。竇研等（2015）也發(fā)現(xiàn)在中國渤海和黃海等地海水養(yǎng)殖池塘的沉積物中，優(yōu)勢菌群為變形菌門和厚壁菌門。2號蝦塘多數(shù)菌株與Rheinheimera soli的模式菌株NR_044294.1聚為一簇；1號蝦塘多數(shù)菌株與Ac. johnsonii的模式菌株MK294307.1聚為一簇。從聚類分析結(jié)果看出，來源相同的多數(shù)菌株聚為一類，兩個蝦塘的抗性菌種有較大差異，這可能是因為露天養(yǎng)殖和大棚養(yǎng)殖水體營養(yǎng)差異造成了抗性菌菌群分布各異。兩個蝦塘檢出的 gyrA基因序列分別與約氏不動桿菌和奧奈達希瓦氏菌相應(yīng)的耐藥基因序列有很高的相似性（97%），而 ermB基因序列均與釀膿鏈球菌相應(yīng)的耐藥基因序列一致（99%－100%）。不同種屬的耐藥細菌，其攜帶的耐藥基因存在高度的相似性，這也說明ARGs水平轉(zhuǎn)移、傳播可能普遍發(fā)生在不同細菌之間。高盼盼等（2009）指出，抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的濫用不僅會引起水生動物體內(nèi)的抗生素殘留，而且在使用過程中未被水生生物吸收的抗生素以及隨水生生物糞便排泄的抗生素和穿過網(wǎng)箱未被生物食用的飼料中的抗生素最終溶入海水或隨懸浮物沉降匯集于底部沉積物。殘留在生物體內(nèi)和進入環(huán)境中的抗生素會在養(yǎng)殖生物的腸道細菌內(nèi)和環(huán)境細菌內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生攜帶抗性基因的抗藥菌株，經(jīng)過質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移等機制將ARGs傳播給其他的細菌。

4 結(jié)論

通過對養(yǎng)殖蝦塘中耐藥細菌分離鑒定及 ARGs的檢測分析，初步了解蝦塘養(yǎng)殖環(huán)境中諾氟沙星和紅霉素兩種抗生素耐藥菌的種類及其耐藥基因污染情況。養(yǎng)殖蝦塘底泥和水體中均存在一定比例的耐藥菌，其中，蝦塘底泥和水體中紅霉素耐藥細菌的比例均高于 10%，且多數(shù)耐藥細菌攜帶相應(yīng)的ARGs。不同養(yǎng)殖模式蝦塘中耐藥細菌分布存在差異，水體富營養(yǎng)化蝦塘中致病性氣單胞菌屬細菌數(shù)量較多；而健康養(yǎng)殖環(huán)境中，不動桿菌和微桿菌等土著細菌攜帶ARGs比例也較高。由于ARGs在不同種屬細菌間水平遷移的概率較高，因此，掌握養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs污染現(xiàn)狀，對制定科學(xué)、合理的抗生素使用方案、減少ARGs在不同細菌、生境中的傳播擴散具有重要意義。