趙金平，黃博珠，徐小靜，鐘英立，陳蓉，張貴剛，肖文，向運榮

廣東省環(huán)境監(jiān)測中心，廣東 廣州 510308

二噁英類（Dioxins）是多氯二苯并-對-二噁英（PCDDs）和多氯二苯并呋喃（PCDFs）的統(tǒng)稱，是一類具有急性致死毒性，高致癌、致畸、致突變，內(nèi)分泌干擾及具有生殖和發(fā)育毒性的持久性有機污染物（Hites，2011；Schecter et al.，2006）。制漿造紙被被列為中國二噁英排放重點源和二噁英減排優(yōu)先控制重點行業(yè)之一（王軍玲等，2011；楊傳璽等，2014）。目前國內(nèi)對垃圾焚燒行業(yè)二噁英排放關(guān)注度較高（李雁等，2019；楊文武等，2019；林斌斌等，2018），作為制漿造紙行業(yè)中二噁英主要來源的漂白工藝雖然日漸得到關(guān)注（楊玲等，2006），但對氯漂白工段產(chǎn)生的二噁英研究相對較少。

高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜（high resolution gas-high resolution mass spectrometer，HRGCHRMS）由于其極低的檢測限、高靈敏度、高選擇性，定性定量準(zhǔn)確等優(yōu)點是目前化學(xué)分析的主要方法，但由于該方法樣品前處理步驟繁瑣，處理周期長、成本高，對定性、定量用的標(biāo)準(zhǔn)樣品有很高的要求，同時對實驗室和操作人員也有較高要求，使得該方法無法被廣泛應(yīng)用且數(shù)據(jù)獲得速度較慢。目前，國內(nèi)外已經(jīng)研究出多種二噁英生物檢測法方法（如EPA 4405、4425、4435方法），該方法可快速開展二噁英的篩選檢測（周志廣等，2013；Wang et al.，2012），為造紙行業(yè)中二噁英監(jiān)管提供可行性。

本研究通過對珠三角兩家典型制漿造紙廠的氯漂白工段廢水的監(jiān)測，基于 HRGC-HRMS方法和國內(nèi)應(yīng)用較廣的生物檢測方法（熒光素酶的化學(xué)激活報告基因方法（Chemically Activated LUciferase eXpression，CALUX））開展二噁英的分析（周志廣等，2013；籍龍杰等，2016；許利等，2016；周志廣等，2011），掌握制漿造紙廠氯漂白工段廢水二噁英排放特征，同時了解HRGC-HRMS法和 CALUX法分析二噁英的可比性，以期為CALUX方法應(yīng)用于造紙行業(yè)二噁英快速篩選和分析提供科學(xué)依據(jù)，進而為管理部門的行業(yè)決策提供及時有效的數(shù)據(jù)支撐。

1 樣品采集與分析

1.1 樣品的采集

依據(jù) HJ77.1—2008《水質(zhì) 二噁英類的測定 同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法》，選取珠三角兩家典型具有氯漂白工序的制漿造紙企業(yè)（企業(yè)A和企業(yè)B），于2019年1月中下旬進行樣品采集，每家企業(yè)現(xiàn)場各采集3個樣品，每個樣品采集的廢水量為40 L，水樣富集（速率為50 mL·min-1）過程要防止廢水不經(jīng)濾膜直接滲漏，在濾膜發(fā)生堵塞的情況下及時更換濾膜。最終獲得樣品7個（包括1個現(xiàn)場空白），除了現(xiàn)場空白，其他6個樣品均包括顆粒相和水相。

采樣前，XAD-2樹脂和聚氨基甲酸乙酯泡沫用去離子水和丙酮清洗3遍后真空干燥，再依次用甲苯和二氯甲烷各進行索氏提取24 h，凈化后的樹脂再次真空干燥后備用；0.45 μm混合纖維微孔濾膜（直徑為200 mm，上海新亞），使用前拆封并用甲苯?jīng)_洗3遍后使用；固相萃取儀各關(guān)鍵部分使用前依次用甲醇、丙酮、二氯甲烷浸濕的脫脂棉擦拭干凈。采樣前 XAD-2樹脂、聚氨基甲酸乙酯泡沫和濾膜先用甲苯溶劑潤濕，廢水采集結(jié)束后，樣品密封，低溫保存，運回實驗室存放于-20 ℃冰箱。

1.2 樣品提取、分樣與凈化

實驗用到的試劑和凈化材料包括以下幾種：二噁英標(biāo)樣、農(nóng)殘級正己烷、甲苯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、、壬烷標(biāo)準(zhǔn)品；優(yōu)級純濃硫酸。其他材料包括：超純中性硅膠（60－120目）、酸性活化氧化鋁、石墨化活性炭、Celite 545硅藻土、XAD-2樹脂、無水硫酸鈉等。

CALUX方法用到的材料包括：CALUX細胞株（Xenobiotic Detection System International，Inc.）、磷酸鹽緩沖鹽片（生物級）、無菌移液管、細胞培養(yǎng)皿、錐形/尖底無菌聚丙烯離心管、彈扣蓋式低吸附無菌微量離心管、96孔底透微孔板、可立外旋凍存管、96微孔板封板膜、胎牛血清（澳洲源）、熒光霉素試劑盒、ULR-移液器吸頭、NEST加樣槽、細胞培養(yǎng)基（RPMI 1640）、胰蛋白酶[0.5%Trypsin-EDTA(10×)，no Phenol Red]、青鏈霉素混合液等。

經(jīng)冷凍干燥后的樣品，用300 mL甲苯索氏抽提24 h。提取后的液體經(jīng)濃縮近干，用16 mL二氯甲烷將樣品分多次轉(zhuǎn)移至22 mL樣品瓶中，氮吹干，將樣品用正己烷轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容。將10 mL樣品一分為二，一份用于 HRGC-HRMS分析，一份用于CALUX分析。

開始凈化前，在用于 HRGC-HRMS分析的樣品中加入 20 μL 100/200 ng·mL-1EPA-1613 LCS 提取內(nèi)標(biāo)，用于CALUX分析的樣品不加提取內(nèi)標(biāo)。樣品經(jīng)濃硫酸凈化，依次過酸性硅膠柱、酸性氧化鋁柱和碳層析柱凈化。凈化洗脫液經(jīng)濃縮、氮吹轉(zhuǎn)移至尖底瓶中，樣品自然晾干后，用于HRGC-HRMS分析的樣品加入 20 μL 100 ng·mL-1EPA-1613ISS 進樣內(nèi)標(biāo)至尖底樣品瓶中，待高分辨儀器分析。

用于CALUX分析的樣品經(jīng)上述方法凈化后，往晾干的樣品瓶中加入 200 μL二甲基亞砜（DMSO），在 18 ℃以上避光保存，待分析。進行生物試驗時，從上述樣品瓶中取出4.5 μL樣品，加入 450 μL PRMI 1640培養(yǎng)液（1% Penicillinstreptomycin+8% FBS）后混勻。在已添加了細胞的96孔板上，每孔加入100 μL混合液，培養(yǎng)24 h（生物培養(yǎng)箱環(huán)境為 37 ℃，CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%）。采用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測量發(fā)光度，通過發(fā)光度計算PCDD/Fs濃度。

1.3 儀器分析

HRGC-HRMS的分析條件如下：高分辨氣相色譜/高分辨雙聚焦磁式質(zhì)譜聯(lián)用儀，載氣流速為1.0 mL·min-1，色譜柱為 HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣量為1 μL，不分流進。色譜柱升溫程序：初始溫度為170 ℃保持1.5 min，然后以 20 ℃·min-1的速率升至 220 ℃，1.0 ℃·min-1升至 240 ℃，最后，以 5 ℃·min-1升至 300 ℃, 保持9 min。進樣口溫度為280 ℃。質(zhì)譜條件：分辨率大于10000，溶劑延遲時間20 min，電子轟擊源：EI，離子源溫度：280 ℃，SIM掃描模式，傳輸管線溫度：280 ℃。

CALUX的檢測儀器酶標(biāo)儀（Centro XS3LB 960）參數(shù)設(shè)置如下，Dispense條件：Injector為3，Volume為100，Speed為middle，Measure operation為 by well，Repeated operation 為 Yes；Kinetic條件：Total Time為10.0，Counting Time為1.00，Repeats為 11，Delay 為 0.0，Measure operation 為 by well。

1.4 質(zhì)量保證與質(zhì)量控制

無論是HRGC-HRMS方法還是CALUX方法，實驗過程中均分析了1個現(xiàn)場空白和1個實驗室空白，HRGC-HRMS檢測結(jié)果顯示，現(xiàn)場空白和實驗空白中OCDD是主要干擾物，但是其檢出的濃度均小于方法檢出限，因此可以忽略；CALUX檢測結(jié)果顯示，現(xiàn)場空白和實驗空白中均未檢出二噁英類化合物，滿足方法要求（CV值＜20%）。HRGC-HRMS提取內(nèi)標(biāo)回收率在54.4%－124%，符合國標(biāo)HJ77.1—2008方法的質(zhì)控要求。

表1 制漿造紙廢水中二噁英檢測結(jié)果表Table 1 Detected results of dioxin in waste water pg·L-1

2 結(jié)果與討論

2.1 HRGC-HRMS檢測廢水二噁英污染特征

表1給出了兩家造紙企業(yè)氯漂白工段后廢水中二噁英的污染特征。從中可以看出A企業(yè)廢水中二噁英的質(zhì)量濃度為 1481－2124 pg·L-1，均值為1712 pg·L-1，毒性當(dāng)量為 19.0－25.5 pg·L-1，均值為21.4 pg·L-1；B企業(yè)廢水中的二噁英的質(zhì)量濃度為 12.4－20.8 pg·L-1，均值為 17.6 pg·L-1，毒性當(dāng)量為 1.46－2.16 pg·L-1，均值為 1.89 pg·L-1。A 企業(yè)氯漂白工藝產(chǎn)生廢水中二噁英濃度均值和毒性當(dāng)量均值分別是B企業(yè)的97.3倍和11.3倍。按照GB3544—2008《制漿造紙工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》中車間或生產(chǎn)設(shè)施廢水排放口二噁英的排放限值（30 pg·L-1）毒性當(dāng)量評價，兩家企業(yè)廢水中二噁英均未超標(biāo)。表 1同時給出了兩家企業(yè)廢水中二噁英的指紋信息，對于分析二噁英的產(chǎn)生機制與來源解析有重要意義。由表中可以看出，A企業(yè)以PCDDs為主，占整個二噁英濃度水平的98.3%－98.6%，是PCDFs的56.9－68.8倍；而B企業(yè)則以PCDFs為主，占整個二噁英濃度水平的 58.7－60.8倍，是 PCDDs的 1.4－1.5倍。A企業(yè)的單體分布特點與付建平（2013）研究的珠三角造紙行業(yè)中二噁英單體分布特征基本一致，B企業(yè)則與青憲等（2014）報道的某造紙廢水中二噁英分布特征一致。兩家企業(yè)廢水中PCDD/Fs單體特征不一致，說明即使二噁英產(chǎn)生的主要環(huán)節(jié)在漂白工藝，但企業(yè)漂白工藝的不同可能是直接影響二噁英產(chǎn)生的主要原因，這與兩家企業(yè)目前采取的漂白工藝不同也是一致的，A企業(yè)制漿漂白工段主要是氧化氯漂白技術(shù)，B企業(yè)則除了氧化氯，主要采用臭氧漂白技術(shù)。此外，造紙來源的不同可能是另外一個影響企業(yè)廢水中二噁英產(chǎn)生另外一個重要原因。有文獻報道，廢水中較高含量的OCDD，反映了五氯酚可能是二噁英污染的主要來源（Zheng et al.，2001），而五氯酚曾用于造紙行業(yè)中木材、紙漿及紙制品的防腐（楊左軍等，2010），A企業(yè)造紙的原材料是以桉木為主，竹子為輔的混合材料，B企業(yè)則是以木材為原材料。

與同類研究相比，A造紙漂白工段廢水中二噁英濃度1481－2124pg·L-1，高于青憲等（2014）報道的造紙廢水、付建平等（2013）研究珠三角7家造紙廠廢水和Zheng et al.（2001）報道的造紙廢水中二噁英濃度 239 pg·L-1、4.75－80.05 pg·L-1（均值為 36.16 pg·L-1）和 744.5 pg·L-1，但就毒性當(dāng)量而言，A企業(yè)廢水中二噁英毒性當(dāng)量為 19.0－25.5 pg·L-1，低于青憲等（2014）和 Zheng et al.（2001）的研究結(jié)果 41.0 pg·L-1和 315.6 pg·L-1的毒性當(dāng)量水平，低于Wang et al.（2012）在2012年報道的我國6家造紙廠次氯酸鹽漂白工藝排放廢水中二噁英毒性濃度水平 6.51－261 pg·L-1（均值為 83.21 pg TEQ·L-1），同時低于王志芳等（2012）報道的草漿和葦漿造紙企業(yè)二噁英毒性當(dāng)量41.8－125 pg·L-1；但高于付建平等（2013）研究的珠三角造紙廢水二噁英毒性當(dāng)量水平 0.21－2.02 pg·L-1（均值為 1.00 pg·L-1），同時也高于王志芳等（2012）報道的竹漿和蔗渣漿造紙企業(yè)二噁英毒性當(dāng)量 7.46－19.7 pg·L-1。就B企業(yè)而言，無論是廢水中二噁英濃度水平還是其毒性當(dāng)量，均明顯低于文獻報道值。

表2 造紙廢水中二噁英的生物檢測結(jié)果Table 2 Detected results of dioxin in waste water by CALUX method

2.2 CALUX檢測廢水二噁英毒性當(dāng)量水平

CALUX方法是基于生物基因，把小鼠的細胞色素 P450基因啟動子（CYP1A1）和螢火蟲的熒光素酶合成基因，重組到小鼠肝癌細胞上。二噁英類的脂溶性污染物透過細胞膜與細胞內(nèi)芳香烴受體（AhR）可逆性結(jié)合成配體，進入細胞核內(nèi)。在細胞核內(nèi)配體-AhR與核內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白（ARNT）結(jié)合，形成配體-AhR-ARNT復(fù)合物，特異性的復(fù)合物與染色體上的二噁英表達區(qū)域（DRE，Dioxin Response Element）結(jié)合，并激活細胞合成熒光素酶（許利等，2016；張諾等，2014）。該測試系統(tǒng)合成的熒光素酶量及熒光強度與測定系統(tǒng)中加入的二噁英量呈正相關(guān)，熒光強度則可以通過酶標(biāo)儀進行讀取，從而獲得二噁英總的毒性當(dāng)量水平。

表2所示為CALUX法測定的6個廢水中二噁英的毒性當(dāng)量。從中可看出采用CALUX法檢測的3次結(jié)果基本相同，除了A企業(yè)第3個樣品3次檢測CV值超過10%外，其他樣品均控制在5%以內(nèi)，最低的僅為1.8%，空白樣品3次檢測結(jié)果均為未檢出，可見其整個實驗流程和實驗耗材的預(yù)處理達到CV值應(yīng)＜20%質(zhì)控要求。同時可以看出，CALUX法二噁英毒性當(dāng)量的實測值均高于 HRGC-HRMS檢測出的廢水中二噁英的毒性當(dāng)量結(jié)果，主要原因是CALUX法在檢測二噁英類化合物的過程中，測定的樣品中可能含有其他會激活 AhR受體的芳烴類物質(zhì)（周志廣等，2013），如果凈化過程能將芳烴類物質(zhì)去除，則儀器法和生物法值將更接近；此外，儀器法和生物法中毒性當(dāng)量系數(shù)不同也是造成偏差的原因（Anezaki et al.，2009）。

如果按照《制漿造紙工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB3544—2008）中30 pg·L-1毒性當(dāng)量排放限值評價，可以看出A企業(yè)毒性當(dāng)量33.8－37.5 pg·L-1（均值為35.3 pg·L-1）稍微高于排放限值，因此，在實際監(jiān)測過程中需要對該結(jié)果進行核實。雖然表1給出的 HRGC-HRMS檢測結(jié)果未超標(biāo)，但其毒性當(dāng)量也接近GB3544—2008中規(guī)定的廢水中二噁英的排放限值，所以對其進行核實意義重大。B企業(yè)廢水中二噁英毒性當(dāng)量為 4.44－6.52 pg·L-1（均值為5.75 pg·L-1），遠低于排放限值，無需再用HRGC-HRMS法核實，表1中給出的B企業(yè)檢測結(jié)果同樣也是遠低于廢水中二噁英排放限值，兩種方法結(jié)果是一致的。A企業(yè)3次CALUX法檢測值分別是HRGC-HRMS法檢測結(jié)果的1.8、1.8、1.5倍；B企業(yè)CALUX法檢測值分別是HRGC-HRMS法檢測結(jié)果的 3.2、2.9、3.1倍，由此可知，就兩種方法而言，對于濃度較高的廢水樣品，CALUX法檢測值與HRGC-HRMS檢測值更接近。

2.3 HRGC-HRMS與CALUX檢測結(jié)果的相關(guān)性

圖1所示為造紙廢水中二噁英HRGC-HRMS法與CALUX法檢測結(jié)果之間的相關(guān)性。從圖中可以看出，B企業(yè)兩種方法檢測結(jié)果之間相關(guān)性較好，3個樣品的r2分別為0.95、0.93和0.95；A企業(yè)兩種方法檢測結(jié)果的r2則分別為0.59、0.99和0.52。由此可知，HRGC-HRMS法與CALUX法對6個樣品檢測結(jié)果均呈現(xiàn)正相關(guān)，但由于樣品量較少，且CALUX法也僅僅做了3次獨立實驗，所以樣品獨立實驗結(jié)果的相關(guān)性還存在一定的差異。但3次CALUX法獨立實驗結(jié)果之間的CV值較低更能反映結(jié)果的可靠性，以及與HRGC-HRMS法檢測結(jié)果之間的倍數(shù)可比性更能說明生物法的準(zhǔn)確度。

CALUX法雖然只測定了2, 3, 7, 8-取代二噁英類總毒性當(dāng)量（如表2），不能給出如表1所示17種二噁英單體化合物的濃度特征，但由于其周期短、分析成本低，可平行測定大量樣品，同時對環(huán)境樣品的檢出限可以達到pg·g-1或ng·L-1水平的特點，因此將其應(yīng)用于大規(guī)模二噁英類背景或污染調(diào)查具有儀器法無可比擬的優(yōu)勢。從兩種方法檢測結(jié)果的對比來看，同樣顯示出CALUX法應(yīng)用于二噁英檢測的可行性和可操作性。

圖1 造紙廢水樣品HRGC-HRMS法與CALUX法檢測結(jié)果的相關(guān)性Fig. 1 Correlation of results between HRGC-HRMS and CALUX method

3 結(jié)論

應(yīng)用HRGC-HRMS法和CALUX法測定了珠三角兩家典型具有氯漂白工藝的制漿造紙企業(yè)廢水中二噁英污染特征和毒性當(dāng)量水平，結(jié)果可為珠三角地區(qū)具有氯漂白工藝的制漿造紙企業(yè)二噁英的污染防治和監(jiān)管提供了數(shù)據(jù)支撐和技術(shù)支持，并將CALUX法有效應(yīng)用于制漿造紙企業(yè)廢水中二噁英的快速檢測，進而節(jié)約企業(yè)和管理部門二噁英檢測成本、時間成本。

CALUX法與目前普遍采用的HRGC-HRMS法相比，后者檢測值會偏低一些，但較為準(zhǔn)確；前者則由于其快速，檢測靈敏度和準(zhǔn)確性等近似于HRGC-HRMS，同時低成本和分析周期短的特點，則適用于大規(guī)模二噁英樣品的快速半定量篩選。將CALUX法和HRGC-HRMS法結(jié)合，可確保數(shù)據(jù)的快速和精準(zhǔn)，有助于企業(yè)和管理部門對二噁英污染情況進行及時防控和有效監(jiān)督。